本研究构建2套相同的1号MBBR和2号MBBR，实验装置如图1所示。MBBR反应桶有效容积为800 L，MBBR载体填充率为30%。反应器底部曝气采用多管砂芯曝气，曝气设置好氧 6 h，间隔2 h。1号和2号MBBR分别对应实验室A、B座污水，反应器进水方式采用间歇式进水，实验来水经格栅除杂、紫外杀菌后进入反应器，MBBR连续运行的水力停留时间(HRT)为8~12 h。出水经过紫外杀菌后进入沉淀池，检测出水水质后排放。

MBBR填料挂膜采用闷曝自然挂膜法，活性污泥取自武汉沌口污水处理厂脱水污泥，通过添加0.02%葡萄糖间隔曝气活化24 h，取SV₃₀沉降在5 min左右的污泥，按照活性污泥和污水1∶2的比例投放，曝气时间为2 h，间隔时间为1 h^[13]。经过约20 d，填料挂膜成功，MBBR运行处理实验室污水。MBBR处理实验室污水期间为自然环境温度，实验持续时间为106 d。每3 d，利用便携式多参数分析仪(HQ30D，哈希公司，美国)现场测定系统的T_w、DO、pH。同时，采集进出水水样，分别采用重铬酸盐法(GB 11914-1989)、纳氏试剂比色法(GB 7479-1987)测定样品的COD、${\rm{NH}}_4^ + $-N。

在反应器运行7、37、64、97 d(每月下旬)时，取填料生物膜提取总DNA，生物膜总DNA的提取按照土壤细菌DNA提取试剂盒(fast DNA SPIN kit for soil，MP biomedicals)的操作方法。总DNA利用微量紫外分光光度计(ND-1 000，Fisher Scientific，USA)检测其浓度和纯度，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的完整性，并对其进行高通量测序。

采用Illumina MiSeq平台对细菌群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序，运用QIIME软件检查并剔除嵌合体等疑问序列，对获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列进行统计。利用R软件统计样本细菌群落多样性((即Alpha多样性)以及在各分类水平的组成并进行分析。用Canoco for Windows 4.5软件对细菌优势菌属的相对丰度和环境因子进行冗余分析(redundancy analysis, RDA)。

图2是MBBR处理污水期间T_w的变化。由图2看出，T_w下降的趋势基本相同，由前期的26 ℃下降到中期的16 ℃，再到后期的10 ℃。水温是MBBR处理污水过程中重要的环境因子之一，对MBBR出水水质和生物膜微生物群落的演变具有显著的影响^[14]。

图3是MBBR处理污水期间DO的变化。1号和2号MBBR的DO含量整体保持在(4.8±0.3) mg·L⁻¹和(5.0±0.2) mg·L⁻¹。1号反应器在第94天时，DO含量降到最低3.8 mg·L⁻¹，2号MBBR在94~106 d时，DO含量降低到3.7~4.3 mg·L⁻¹。有研究^[15]表明，微生物在分解利用污水中有机物等物质时，会大量消耗DO，从而引起污水中的DO含量波动。反应器DO含量增高有利于有机质的分解和硝化反应的进行，较低的DO含量有利于脱氮微生物进行反硝化作用。

图4是MBBR处理污水期间pH的变化。1号、2号MBBR的pH稳定在7.5±0.3、7.8±0.3左右，整体偏弱碱性。1号反应器在第103天时，pH最高达到8.1，2号反应器在第19天时，pH最低下降到6.9。pH对微生物代谢活动影响显著，硝化过程产酸积累会导致反应受抑制，碱性环境有利于${\rm{NH}}_4^ + $-N的去除^[16]。反硝化过程产生的碱度会消耗环境酸度，较低的 pH有利于污水TN的去除。MBBR处理过程中pH处于弱碱性，有利于硝化反应的进行。

图5(a)和图5(b)是MBBR进出水水质COD的变化。实验期间，1号和2号MBBR进水COD分别为31.02~1 003.16 mg·L⁻¹和11.71~662.69 mg·L⁻¹。1号MBBR整体出水COD低于50 mg·L⁻¹，但在前22 d，出水COD为33.28~342.75 mg·L⁻¹。监测数据表明，进水COD最高时(1 003.16 mg·L⁻¹)，现有微生物种类和数量不能使耗氧有机污染物(以COD计)完全降解，随着微生物快速繁殖适应环境，出水COD逐渐下降且恢复正常值。2号MBBR平均出水COD低于50 mg·L⁻¹，而在后期第97 天，出水COD达到126 mg·L⁻¹，后期较低水温(10 ℃)和高有机负荷的进水(349 mg·L⁻¹)是造成出水COD增加的原因。本研究中MBBR进水具有滞后性，高有机负荷的污水会对出水造成影响，而现有微生物种类、数量不足和低T_w是引起MBBR出水COD增高的主要因素^[17]。

图6(a)和图6(b)为MBBR进出水${\rm{NH}}_4^ + $-N的变化结果。1号和2号MBBR进水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度分别为0.20~9.69 mg·L⁻¹和0.44~12.71 mg·L⁻¹，进水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度低但波动较大。1号和2号MBBR平均出水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度保持在0.76~1.25 mg·L⁻¹左右。1号MBBR在第46~52天，出水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度均高于进水，最高可达到6.19 mg·L⁻¹。环境因子数据表明，在49 d时，DO含量只有4.3 mg·L⁻¹，pH降低到6.5，下降的DO和弱酸性的环境不利于硝化反应的进行，硝化细菌不能快速将${\rm{NH}}_4^ + $-N转化为$ {\rm{NO}}_3^{-}$-N、${\rm{NO}}_2^{-} $-N，导致${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度积累，造成出水的${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度较高^[18]。2号MBBR在后期97 d时(T_w=11.5 ℃，DO=3.7 mg·L⁻¹)，出水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度升高到3.28 mg·L⁻¹，随后又快速恢复到正常水平，反应器较低的T_w和DO影响出水${\rm{NH}}_4^ + $-N。结果表明，随着季节T_w下降，MBBR仍能稳定去除污水中的${\rm{NH}}_4^ + $-N，出水${\rm{NH}}_4^ + $-N浓度保持在达标值，而T_w、DO、pH等环境因子是引起出水${\rm{NH}}_4^ + $-N波动的重要因素。

MBBR不同月份样品OTU数和Alpha多样性指数变化见表1。从表1可以看出，2个MBBR生物膜样品的高通量测序总共获得410 649个高质量的序列，覆盖率达到97.98%~99.97%。1号和2号MBBR样品OTU总数分别达到4 512、5 533(97%的序列相似度)。细菌群落多样性可以用侧重体现群落丰富度的Chao1和群落均匀度的Shannon指数来反映，1号和2号MBBR在12月份的Chao1指数均最大(1 689、2 050)，Shannon指数没有明显降低。2个MBBR在冬季12月份细菌群落多样性指数仍然保持在较高值，这说明填料微生物能很好地适应冬季低温环境，群落微生物多样性较高，从而能在低温环境下稳定地处理生物实验室污水。

图7反映2个MBBR样品的Venn图。1号MBBR(A)在9、10、11、12月共有OTU数388个，独有的OTU数分别有211、171、205和677个；2号MBBR(B)在9、10、11、12月共有OTU数271个，独有的OTU数分别有383、368、213和995个。2个MBBR在不同月份都具有丰富的物种，2号MBBR的物种数量高于1号，在12月，2个MBBR独有的物种均达最高，说明MBBR在不同月份物种组成具有相似性，但每月都有其独有的物种，随着不同月份T_w的变化，物种数量也有相应的动态变化。

图8为 MBBR细菌群落相对丰度的变化。由图8(a)看出，MBBR处理实验室污水过程中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)是主要优势菌门。变形菌门是所有MBBR样品最大的优势菌门，占据61.87% ~ 85.78%的相对丰度。变形菌门包含多种代谢类型，广泛分布在填料生物膜好氧和厌氧环境中，在MBBR除碳脱氮中发挥关键性作用^[19]。拟杆菌门是主要优势菌门之一，1号MBBR样品拟杆菌门在9月和10月的相对丰度分别是3.12%和11.41%，在11月和12月的相对丰度升高到21.6%和15.05%。同样，2号MBBR样品相对丰度在11月和12月也升高到24.1%和16.73%。拟杆菌门的相对丰度在水温较低的环境显著增加，说明拟杆菌门细菌可以很好地适应低温环境，从而在MBBR低温处理污水中发挥显著作用^[20]。

图8(b)和图8(c)为MBBR样品细菌属水平相对丰度的变化。可以看出，在MBBR细菌群落属水平上，动胶菌属(Zoogloea)占据8.27%~15.96%的相对丰度，是明显的优势菌属之一。有研究^[21]表明，动胶菌属是化能异养的专性好氧菌，通过群聚形成菌胶团，具有吸附、氧化分解、凝聚沉降等能力，高丰度的动胶菌属可以稳定生物絮团，保证充足的生物量分解污水中有机物，从而降低污水中COD值。氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)在1号、2号MBBR样品中相对丰度最高分别达到15.78%(9月)和11.06%(10月)；而在12月，分别下降到4.02%和0.21%，氢噬胞菌属更适合T_w较高的季节。氢噬胞菌属的细菌具有降解多环芳烃化合物(PAHs)的能力，通过产酶作用于苯环，经过氧化反应，进一步代谢为邻苯二甲酸等中间产物^[22]。氢噬胞菌属可能在降解实验室污水的多环芳烃物质中发挥重要作用。假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度随T_w变化较显著，1号的假单胞菌属从9月的0.77%升高到12月的22.95%，同样2号的假单胞菌属从9月的0.32%上升到12月的5.86%。这表明假单胞菌属能很好地适应低温环境，成为生物膜的优势菌种，是低温环境重要的脱氮微生物之一。

在11月和12月，MBBR出水水质能稳定保持在较低浓度，这是因为适应低温环境的微生物(如假单胞菌属)逐渐增加成为优势菌属，而不适应低温的微生物(如氢噬胞菌属)逐渐减少，通过生物膜菌群的演替，保证了MBBR在秋冬季节仍然能稳定达标的处理实验室污水。

图9是环境因子与细菌群落的冗余分析(RDA)结果。MBBR的RDA排序图第1和第2主轴分别解释了优势菌群相对丰度变化的37.67%和23.96%，第1轴上，相关性较大的环境因子是DO(r=− 0.918)、${\rm{NH}}_4^ + $-N(r=0.687)和pH(r=−0.634)；第2轴上，相关性较大的环境因子是COD(r=0.811)和T_w(r=−0.668)。可以看出，DO与短波单胞菌属(Brevundimonas)、气单胞菌属(Aeromonas)具有显著正相关性，较高的DO有利于短波单胞菌属和气单胞菌属的生长。短波单胞菌属具有广谱的烷烃类有机物降解能力，还能降解芳香族有毒物质^[23]。pH与脱氯单胞菌(Dechloromonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)具有显著正相关性，这说明脱氯单胞菌和固氮弧菌属更适合碱性的环境。脱氯单胞菌和固氮弧菌属是常见的脱氮微生物，脱氯单胞菌具有很强的硝酸盐还原能力，固氮弧菌属具有脱硫脱氮的重要作用^[24-25]。T_w明显与黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)具有负相关性，黄杆菌属和假单胞菌属在较低T_w环境成为优势菌种，从而在低温环境发挥分解有机物和脱氮的重要作用。综上所述，T_w、DO、pH是影响MBBR细菌群落更替的重要环境因子，对MBBR处理生物实验室污水产生较大影响。

1)随着秋冬季节T_w从26 ℃下降到10 ℃，MBBR能稳定达标地处理实验室污水。当进水COD、${\rm{NH}}_4^ + $-N分别为200 mg·L⁻¹和6 mg·L⁻¹时，MBBR出水COD、${\rm{NH}}_4^ + $-N去除率仍然保持在75%和80%左右。

2)通过RDA分析发现，DO与短波单胞菌属、pH与脱氯单胞菌、固氮弧菌属具有显著正相关性，T_w与假单胞菌属、黄杆菌属具有显著负相关性，环境因子T_w、pH、DO显著影响生物膜细菌群落的变化。

3)高通量测序表明，MBBR样品中变形菌门、拟杆菌门和浮霉菌门是生物膜主要优势菌门，T_w的下降引起拟杆菌门的相对丰度显著增加，假单胞菌属和黄杆菌属的相对丰度随T_w的降低而极大地升高，动胶菌属相对丰度保持稳定，说明细菌群落动态更替是MBBR出水水质保持稳定达标的重要原因。