本试验采取室内模拟湿地的方式，设置3种水位条件：a. 高水位（淹水15 cm），b. 中水位（淹水7 cm），c. 无水位（保持湿润即可），每种水位条件设置9组平行，共27个处理。试验在西南林业大学农村污水处理研究所温室进行，以黑色聚乙烯桶（高32 cm，内口径44 cm，底径32 cm）内栽植湿地植物的方式人工模拟湿地，底泥取自云南省昆明市盘龙区金汁河底泥（0—20 cm），挺水植物选择常见的湿地植物狭叶香蒲，购自云南省昆明市泛亚苗圃基地，使用Na₂HAsO₄·7H₂O（分析纯）模拟富砷环境，砷的底泥含量为300 mg·kg^−1[19]。

具体操作如下：将沟渠底泥剔除石块及植物根茎等杂物之后，混合均匀，通过外源添加Na₂HAsO₄·7H₂O（以As计）的方式设置富砷底质，将富砷底泥加至黑色聚乙烯实验桶12 cm处，放置平衡后栽种狭叶香蒲幼苗。水位通过每周定量加水保持在设定高度，待香蒲稳定2个月后，进行实验样品采集。

本试验分别于湖滨湿地典型挺水植物香蒲的生长期、繁盛期、枯落期对底泥进行破坏性采样。对香蒲叶、茎进行收割后，桶中淹水采用虹吸式排水方式抽出，底泥样品采自植物根系区，每种水位条件均随机采集3个平行作为重复，剔除植物根系之后混合均匀，将混匀后的底泥样品分为两部分：①用于Illumina PE250高通量测序，样品以干冰低温保存送往上海凌恩生物科技有限公司进行微生物测序工作；②用于污染指标测定，将样品装入自封袋带回实验室，放置阴凉处自然风干后研磨，过160目孔筛，实验待用。

本实验研究测定的指标包括：总氮（TN）、总磷（TP）、土壤有机碳（SOC）、总砷（TAs），测定方法如表1所示。

本模拟实验中所有样品的Illumina PE250测序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成，利用1%琼脂糖凝胶电泳抽取基因组DNA，每个样本3个平行，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。将PCR产物用QuantiFluor^TM -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合，随后进行文库构建，检验合格之后使用Illumina PE250进行上机测序。

采用Excel 2016 对原始数据进行基础性处理；利用SPSS 26对数据进行显著性分析。利用单因素方差分析检验不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中环境条件及污染特征的差异性（One-way-ANOVA, P < 0.05）,平均数之间的多重比较采用LSD检验。文中所有堆积柱状图均由Origin 2018绘制完成，用以表示不同分类水平下细菌群落的组成情况；使用LEFSe识别不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中的关键差异微生物，利用Canoco 5进行冗余分析（RDA），比较底泥污染指标和细菌群落之间的相关性。

由表2可知，水位条件的变化是影响湿地生态系统的主要因子，不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中TN、TP、TAs和SOC具有显著差异（P<0.05），其中，TN含量在不同水位条件下的变化总体表现为：无水位<中水位<高水位，${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量的变化趋势同TN基本一致；随水位的升高呈增加的趋势，${\rm{NO}}_3^{-} $-N含量则表现为：无水位<中水位<高水位无水位；TP含量均表现为中水位条件显著低于无水位条件和高水位条件；TAs含量则随植物生长而减少，对比无水位条件而言，高水位条件下其含量相对较低；SOC含量则表现为繁盛期、枯落期中水位条件显著低于无水位条件和高水位条件。

运用Chaol指数(Chaol index)、Shannon指数(Shannon index)和Simpson指数(Simpson index)对不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中细菌丰度及多样性进行分析。由表3可知，各样品文库的覆盖率(Coverage)范围为97.97%—98.93%，表明本次测序结果能够有效反应湿地底泥中细菌群落的基本情况。Chao1 指数反应的细菌群落丰度变化规律一致，均为：无水位<中水位<高水位，即在实验范围内，淹水程度越大，其菌群丰度越高，这表明水位变化对底泥细菌丰度的影响显著。Shannon指数与Simpson指数通常用于表示α多样性指数，Shannon指数值越大，湿地底泥中细菌群落多样性就越高，Simpson指数则与之相反。Shannon指数和Simpson指数反应的细菌多样性表现为，细菌多样性程度较高的状态以高水位条件居多，例如，Shannon指数均为在生长期和枯落期的高水位条件下最大，Simpson指数则与之相反，这一结果表明，与无水位条件下的细菌多样性相比，水位条件对底泥细菌多样性有显著影响。

湿地底泥是各种微生物参与、物质发生频繁交换、具有高度生活活性的特殊生物环境^[20]，而微生物种类多、分布广、代谢强、繁殖快，被认为是土壤生态系统中最活跃的部分，对外界环境干扰的响应十分敏感。水位条件是影响湿地生态过程的关键因素^[21]，很多研究表明，淹水程度的变化对土壤微生物群落有重要影响^[22-23]。王鹏等通过对鄱阳湖不同水位植被带的土壤细菌群落特征进行研究，发现中等水位梯度下的土壤具有更高的菌群丰度和多样性^[8]；张洪霞等通过对不同淹水条件下滨海芦苇湿地土壤微生物的研究，发现淹水条件下土壤古菌和细菌多样性较高^[24]；张琼琼等研究不同水位深度的植物根系区细菌多样性发现，植物根系区细菌多样性随水位加深而减少^[25]；刘亚军在其研究中表明细菌群落受淹水深度的影响不大^[26]。本试验结果与顾诗云、张洪霞、郭太忠等的研究结果相似^{[24, 27-28]}，在本研究中3种不同水位条件下，香蒲不同生长期湿地底泥中的细菌丰度表现具有一致性：无水位<中水位<高水位。就细菌群落多样性而言，高水位条件下细菌多样性程度较高。造成该结果的原因有两点，一方面，水位条件的变化可直接改变底泥细菌群落的生存环境，水位条件的变化引起的底泥中其他环境因子的变化会导致氧化还原条件发生改变^[29-30]，在水位条件较高时，植物根系区底泥中处于微还原状态，部分砷酸盐(H₃AsO₄)转化为亚砷酸盐(H₃AsO₃)，对底泥及植物危害相对较小，使得一部分砷敏感细菌得以存活，从而影响到底泥中细菌群落丰度和多样性的变化。另一方面，水位条件通过改变植物的生长环境间接影响底泥细菌群落，本研究中的试供植物为典型挺水植物香蒲，它具有根系生物量大及通气组织发达等特点，增加植物根在饱和机制中的输氧能力，促使植物根际形成好氧微生物的微氧环境^[31-32]，因而底泥细菌丰度及多样性在高水位条件下并未降低；另外，较高的水位条件能使得底泥微生物对基质的利用能力增加，植物的生长亦会向底泥中输入大量微生物可利用的碳源，充足的水分条件更利于微生物的生长^[33]。本研究结果显示了微生物群落丰度与多样性对不同水位条件的响应关系基本一致，水位越高，其细菌群落丰度和多样性指数越大，这可以用于指示富砷湖滨湿地在不同水位条件及不同淹没期的生态环境变化，为湖滨湿地做出更好的环境响应提供依据。

在不同水位条件下，门水平分类的优势细菌群落相对丰度具有一定的变化趋势。由图1可知，在本次模拟实验中，富砷湖滨湿地底泥中的五种优势群落分别为Proteobacteria（变形菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）和Acidobacteria（酸杆菌门），这五类细菌约占总测序序列的68.70%—86.06%。其中，变形菌门为细菌群落门水平分类中的绝对优势菌门，生长期、枯落期变形菌门的相对丰度随淹水高度加大总体上呈现减少的趋势，繁盛期则表现为水位越高，相对丰度越小。很多研究表明，变形菌门在湖泊沉积物中具有较高比例^[53],在砷污染土壤中也具有较强的耐受性，因而在砷污染底泥中依然是优势细菌群落，然而在变形菌门中存在大量好氧或兼性细菌，湖泊底泥长期处于高水位淹水状态，变形菌门的相对幅度在高水位条件下较小^[34-35]；绿弯菌门、厚壁菌门、酸杆菌门和拟杆菌门是门水平分类上除变形菌门在之外的优势菌群，这四大菌群对不同水位条件的响应呈现出多样性的特征。绿弯菌门相对丰度的最大值均出现中水位条件，这是由于绿弯菌门是兼性厌氧菌，依靠光能进行光合作用，同时在无氧条件下也能进行无氧呼吸^[36]，中水位梯度下的环境更加适合绿弯菌门的生长；除繁盛期外，厚壁菌的门相对丰度在无水位条件均显著低于高水位，分析原因，或是因为这一微生物群落为无毒的单细胞生物，生活在水中或水分充足、养分少的环境中^[37]，然而生长旺盛期，由于长期处于中、高水位的淹水状态下，植物分泌物数量增加，促使根系区底泥营养物质增多^[38-39]，不利于厚壁菌门的繁殖；在生长期和枯落期，酸杆菌门相对丰度最大值均出现在无水位条件，通常，在淹水状态下，特别是随水位的增加，氧气进入土壤的能力下降，不利于好氧微生物的生存和它们的代谢^[40]，而酸杆菌门属于好氧菌，因而在无水位条件下具有较高的相对丰度，这与Zeglin等的研究结果相似^[41]；拟杆菌门相对丰度在生长期不同水位条件下并无显著变化，但在其繁盛期和衰落期则表现为无水位条件下相对丰度减少，中水位条件下相对丰度增加，这可能是因为拟杆菌门为厌氧菌，更倾向于生活在水位较高的状态^[42]。其他相对丰度较低的细菌群落在不同水位条件下的变化不大。

另外，在变形菌门的纲水平下，包含了Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）、Deltaproteobacteria（δ-变形菌纲）和Alphaproteobacteria（α-变形菌纲）3个亚类，具有丰富的代谢多样性，对于C、N、P等营养元素的循环以及其他污染物的降解具有重要作用^[43]。其中， Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）为优势菌纲，相对丰度最高，γ-变形菌纲以硫酸盐为电子受体降解有机物，具有耐砷性^{[44, 5]}，其在不同水位条件下的变化趋势同变形菌门完全一致，这是因为同种门属的菌群特性具有相似性，但在属水平上细菌群落的结构及多样性仍需更进一步探究。不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥细菌群落结构存在显著差异，这说明底泥细菌具有通过调整自身群落结构以适应环境条件变化的生存机制。

图2为不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中属分类水平上的细菌群落组成，将细菌群落中平均丰度低于2%的部分合并在图中显示（≤2%）；属水平分类中属于分类学数据库分类学谱系的中间等级，没有科学名称，以norank作为标记；uncultured表示属水平分类中未分离培养的细菌群落；unclassified属水平分类中在置信度阈值下，与数据库比对不上的细菌群落。

在不同水位条件下，富砷湖滨湿地底泥中的细菌群落在属水平上完整且相对丰度较高的两个菌群分别是：Steroidobacteraceae_uncultured（固醇杆菌科下的一个未培养属）和Bacteroidetes vadinHA17_norank。Steroidobacteraceae_uncultured总体上无显著差异，但其在枯落期变化相对显著，随水位降低呈现减小趋势，且相对丰度最小值（3.08%）出现在高水位条件下；Bacteroidetes vadinHA17_norank总体上呈现随淹水高度的加大而显著增加的趋势，总体变化趋势一致，其相对丰度最大值出现在高水位条件，这表明水位条件对属水平上细菌优势群落具有一定的影响。

图3为不同水位条件下微生物群落在不同分类水平下的LEFSe分值柱状图，仅得分大于2.0的物种被展示。结果表明，微生物群落在不同分类水平上共有21个物种表现出了显著性的组间差异，无水位条件富集到的具有显著影响效应的目水平物种为Thalassobaculales，中水位条件富集到的具有显著影响效应的目水平物种为Flavobacteriales，科水平物种为Flavobacteriaceae,高水位条件富集到的具有显著影响效应的属水平物种为Clostridium_sensu_stricto_13和Sporacetigenium，这表明微生物群落组成在不同分类水平上对水位变化具有不同的响应特征，也说明了不同水位条件下微生物群落组成的显著变化与特定物种的消长具有明显的相关性^[45]。就门水平而言，以上21个物种分别隶属于Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria、Cyanobacteria、Cyanobacteria等。

图4为不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥细菌门水平分类上群落结构与污染指标的冗余分析（RDA）结果排序图。根据RDA结果排序图中物种箭头和环境箭头之间的夹角判定相关性，呈钝角，为负相关，呈锐角，则为正相关，根据物种到环境因子的垂直距离越小，相关性越强。由图4可知，不同水位条件下，富砷湖滨湿地底泥污染指标与细菌群落之间的相关性存在差异性，底泥污染指标对细菌群落结构的影响程度不同。在无水位条件下（轴1和轴2共解释了68.4%的变量），TN和${\rm{NO}}_3^{-} $-N含量对细菌群落结构的影响程度较强，与变形菌门、酸杆菌门相对丰度呈正相关，与绿弯菌、拟杆菌相对丰度呈负相关；在中水位条件下（轴1和轴2共解释了90.1%的变量），TN、TP、SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N、${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量对细菌群落结构的影响程度较强，其中，SOC与厚壁菌门相对丰度呈正相关，与绿弯菌、酸杆菌相对丰度呈负相关，${\rm{NH}}_4^{+} $-N则与之相反，TP、${\rm{NO}}_3^{-} $-N与变形菌门相对丰度呈正相关。

在高水位条件下（轴1和轴2共解释了77.2%的变量），TP、TAs、SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N、${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量对细菌群落结构的影响较大，其中，TAs、SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N与变形菌门、酸杆菌门呈正相关，与绿弯菌门、拟杆菌门呈负相关，TN与绿弯菌呈负相关，${\rm{NH}}_4^{+} $-N则与Synergistetes（互养菌门）呈正相关。这说明在不同水位条件下，不同的细菌群落对底泥污染元素的敏感程度存在差异。总体而言，TN、TP、SOC以及${\rm{NO}}_3^{-} $-N、${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量对不同水位条件下细菌群落结构具有显著影响。

本模拟实验的研究结果中，富砷湿地底泥在门水平分类上的5种优势细菌群落分别是Proteobacteria（变形菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）和Acidobacteria（酸杆菌门），这些优势菌门中包含了变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等关键差异微生物，LDA分析结果显示关键差异微生物在不同水位条件下具有差异性。其中，变形菌门、厚壁菌门包含了大多数好氧反硝化菌，适宜在水位较低的底泥环境中生存^{[46, 28, 30]}，所以这些菌群在无水位条件和中水位条件下的相对丰度较高，绿弯菌门的相对丰度在中水位条件下最高，可见，淹水程度的变化能够显著影响湿地底泥中优势菌群的结构分布。RDA分析也显示变形菌门与底泥SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N含量呈正相关，与底泥TN含量呈负相关，且水位越高，相关性越强，这与变形菌自身利用SOC及其为底泥提供固氮能力的特性相符合^[30]，这与王鹏等的研究结果一致^[8]。绿弯菌门在砷污染底泥中占有较高的比重^[47]，与TN、${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量呈正相关，与${\rm{NO}}_3^{-} $-N含量呈负相关，且在中水位条件下相关性最强，这是由于绿弯菌为光能自养菌，能够发酵代谢多种碳源，也具有反硝化功能^[48]，更倾向于在营养充足的环境中生存^[49]。3种水位条件下SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N与厚壁菌门相对丰度呈正相关，与酸杆菌门呈负相关，这是由于厚壁菌门相对丰度与底泥营养程度相关，有研究表明，厚壁菌门受到砷污染的抑制^[37]，然而在水分充足的环境下具有较高的营养程度，且其适应性和繁殖能力较强^[50]，故厚壁菌门在中水位条件和高水位条件的相对丰度大于无水位条件，而酸杆菌门大多为嗜酸菌，可降解纤维素、半纤维素、木聚糖、果胶和几丁质等复杂有机物^{[51, 44]}，Zeglin等研究^[41]河流沉积物在不同水位梯度下的细菌群落发现，酸杆菌在较干旱的地区相对丰度较高，本研究结果与其相似，这或与SOC含量相关，土壤水分通过影响微生物活性和底物的可利用性等方面影响SOC分解，进而造成微生物对SOC的分配利用策略不同^[52]。不同水位条件下底泥污染物质是影响细菌群落结构的重要因素，可以对富砷湖滨湿地的生态修复提供有效的生物依据。

本论文研究了不同水位条件下富砷湖滨湿地底泥中细菌群落结构及多样性的变化特征，得出了以下结论：

（1）富砷湖滨湿地底泥中的细菌群落丰度变化具有一致性：无水位<中水位<高水位。就细菌群落多样性而言，高水位条件下细菌多样性程度较高。

（2）在细菌群落结构中，门水平分类上的5种优势菌门为变形菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和酸杆菌门，各优势菌门对不同水位条件的响应表现出多样性的特征。变形菌门纲水平分类上的优势细菌为γ-变形菌纲、δ-变形菌纲和α-变形菌纲3个亚类，γ-变形菌纲相对丰度最高，其在不同水位条件下的变化趋势与变形菌门一致。属水平分类上，相对丰度占比最大的为固醇杆菌科的部分属水平未培养细菌，隶属于变形菌门，且与变形菌门在不同水位条件下的变化特征一致。

（3）TN、TP、SOC以及${\rm{NO}}_3^{-} $-N、${\rm{NH}}_4^{+} $-N含量对底泥中细菌群落的影响显著，其中，TN、SOC、${\rm{NO}}_3^{-} $-N、${\rm{NH}}_4^{+} $-N对细菌优势群落影响最为显著且呈现出多样性的特征。

本文通过模拟实验研究，明晰了不同水位条件对于富砷湖滨湿地底泥中微生物群落结构及多样性具有显著影响，这可以用于指示砷污染湖滨湿地在不同水位条件下的生态环境变化，从而为湿地环境的改善和治理提供科学依据。但是对于水位引起的富砷湖滨湿地底泥中砷形态转化及其与微生物的作用关系并未进行探讨，需进一步详细研究。