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随着社会经济的快速发展，环境污染日趋加剧，导致环境中病原微生物（细菌、寄生虫、病毒和真菌等）滋生，造成环境微生物污染问题严峻。水体、空气、土壤等不仅是这些病原微生物的重要生存环境，同时也是它们的传播介质。例如，生活污水、医院污水、动物粪便以及大气漂浮物和气溶胶等含有丰富有机质，常包含引起人类和动物消化系统、呼吸系统和皮肤病变的致病性大肠杆菌、军团杆菌、肺炎链球菌等病原微生物，污水排放、有机肥农用或大气扩散将这些病原微生物进一步传播扩散，人们可通过直接接触、摄入或吸入环境中的病原微生物，从而引发人类疾病的感染与暴发。据世界卫生组织估计，在全球每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的，全球每年因微生物污染问题带来的经济损失大约为65亿—350亿美元[1]。《中国食品安全发展报告（2019）》指出，我国微生物污染问题仍然突出，是我国第一大食品安全风险[2]。因此，对环境中病原微生物进行监测并追溯其污染来源将对综合评估环境微生物污染程度与污染早期发现、监管与控制环境微生物污染具有重要意义。
环境微生物污染包括细菌性污染、病毒和真菌及其毒素的污染。其中病原细菌引起的疾病最多，是人与动物传染性疾病的元凶之一，包括革兰氏阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等至少110个属；此外，已发现大约有100多种病毒、400多种真菌及多种寄生虫和阮病毒与人类和动物疾病的发生有关[3]。因此对环境中微生物污染情况及其带来的健康风险进行评估是十分必要的。目前对微生物污染的监测常基于少数病原微生物的检测，并不能综合评估环境微生物污染水平，例如水质安全检测常采用粪大肠菌群浓度作为唯一的微生物指标[4]。而且，常见的病原微生物检测方法常基于临床病原菌分析而发展，例如平板培养法、胶体金检测技术、酶联免疫分析技术、免疫磁珠分离技术及双功能抗体检测技术，这些方法在临床中广泛应用，然而由于这些方法具有工作量大、检测灵敏度低、培养时间长等缺陷，尤其环境介质较为复杂，导致这些方法在环境样本中的应用受到限制[5]。
随着分子生物学技术的发展，基于PCR技术、基因探针技术、借助于杂交的生物探针技术以及宏基因组测序技术等可以快速完成病原微生物的检测，不需要前期培养，但基于PCR和探针的技术仍局限于少数病原菌的检测，宏基因组测序技术具有费用高、周期长的缺点。本课题组前期的研究工作开发了一种基于TaqMan探针高通量荧光定量PCR方法（TaqMan-based high-throughput qPCR），可以同时检测33种病原微生物的68个标记基因，包括了可以引发人类胃肠道、肺炎、角膜炎等相关疾病病原微生物的标记基因。相比SYBR GREEN荧光定量PCR方法，TaqMan荧光定量PCR法中增加的探针序列使该方法更特异，荧光收集方式更准确。另外，使用该方法一次检测可同时进行5184个qPCR反应，特别适合用于大量样品的快速检测，故也具有低成本、高通量、方便快捷等优点，可以规避以上研究手段的缺点，基于该芯片我们前期在厦门13个海滨浴场水体中检测到7种病原菌[6]。因此，将该方法应用到其他环境中病原菌的检测，将为环境微生物污染监测和风险评估提供数据基础。
微生物污染来源的鉴定是环境微生物污染监测的另一个主要挑战，其对环境污染修复管理政策的实行具有重要意义。粪便污染是造成环境微生物污染的主要原因之一[7]，不同宿主来源粪便对环境污染有着不同程度的危害，鉴别环境粪便污染来源及污染程度有助于环境微生物污染来源监管，从而促进环境保护。传统的粪大肠菌群等粪便污染指示微生物由于能够在自然环境中存活并繁殖，在各种动物的肠道中没有特异性等缺陷不能分辨粪便污染来源，无法准确评估水体微生物污染状况[8-9]。微生物源示踪技术(Microbial source tracking, MST)的出现解决了这一难题，其可以通过粪便污染宿主或者宿主相关的微生物的DNA序列作为特异标记物以鉴定粪便污染来源[10-12]。这些粪便污染宿主主要包括人类、牲畜（猪、牛、羊、马和兔）、宠物（狗和猫）、家禽（鸡和鸭）及野生动物（鹅和海鸥）等。环境中的粪便污染可能不止来源于一种宿主。目前多数研究采用微生物源示踪技术仅聚焦少数几种指示微生物的标记基因，无法综合评估环境中粪便污染的状况。本课题组前期的研究也建立粪便污染物的高通量qPCR检测技术，可以同时检测10种不同宿主的23个标记基因，包括了常见粪便污染源(人类、反刍动物、家禽、猪、狗)微生物源示踪标记基因，利用该芯片我们发现海滨浴场的粪便污染主要来源于人和狗[6, 13-30]。
污水处理厂汇聚人类生活污水包括人类排泄物等，由于富含有机质等，可能携带大量病原微生物，污水处理过程并不能完全去除所有微生物，其残留微生物随污泥农用或出水排放进入下游环境，危害人类健康。此外，有机粪肥也是病原微生物的一个储存环境，粪肥施用的农田土壤中也可能携带大量不同种类的病原微生物，一旦人群暴露到这些病原微生物中，将可能对人类的生命健康造成极大的危害。本研究利用前期研发的基于高通量qPCR检测技术的病原菌和粪便溯源标记基因芯片，对浙江省H市污水处理厂进出水、德州长期施加有机肥（污泥或鸡粪）或化肥土壤中的微生物污染及粪便污染溯源进行了研究，旨在探明污水处理厂及农田土壤中病原菌种类和分布情况，以及这些病原微生物污染的来源，为环境微生物污染源头管控及环境部门政策制定和管理提供数据基础。
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污水处理厂样品于2014年8月采集自浙江省H市两个城市生活污水处理厂（WWTP1、WWTP2），连续2 d分别采集400 mL进、出水样品，并以1∶1体积比与100%乙醇混合进行预处理，用于固定污水中的微生物，固定的样品置于冰上，6 h内送回实验室处理分析。
长期施加有机肥或化肥土壤样品为以前研究抗生素抗性基因所使用的土壤样品（DZ），该土壤采集于2015年8月，来自中国农业科学院德州试验站，包括了施加鸡粪（Chicken manure, CM）、污泥（Sewage sludge, SS）、尿素（Urea, N）及空白对照（CK）8个处理组，每个处理组3个样品重复，共计24个样品。土壤采集混匀后立即置于干冰中，24 h内运回实验室，放于-80 ℃储存，样品具体信息见表1。
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水样采用0.2 μm硝酸纤维滤膜过滤，按照水质选择过滤体积，将过滤后的滤膜剪成细条，使用FastDNA®土壤DNA试剂盒（MP Biomedical，美国）提取总DNA；称取土壤样品0.5 g左右，使用FastDNA®土壤DNA试剂盒（MP Biomedical，美国）提取总DNA。
使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Nanodrop，美国）检测DNA质量和浓度。DNA储存于−20 ℃供后续使用。
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每个土壤样品称取3.0 g左右，两个技术重复，在105 ℃条件下烘16 h至干燥，测定样品含水率。
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标准曲线的构建：构建携带相应标记基因的标准质粒，并将每个基因的质粒的等拷贝混合，生成标准质粒混合物。用10倍梯度稀释的标准质粒混合物建立标记基因的标准曲线。
引物和分子标记物：本研究所用的检测病原菌和粪便污染的标记基因的引物和探针均已于前期的研究中进行验证与优化，且具有较高的灵敏度与特异度[6]，详见表2和表3。
高通量qPCR 检测：样品(包括水样DNA、质粒和无核酸酶灭菌水阴性对照，每个样品3个技术重复)、引物及探针均采用日本Takara公司SmartChip 多样品纳升分配器分配到SmartChip 纳升芯片(Takara，日本)上，随后将芯片置于SmartChipCycler 仪器上进行高通量qPCR。反应体系为100 nL，包含1×Taq-Man Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems，美国)、1×ROX 参比染料(Invitrogen，美国)、1mg·mL−1牛血清白蛋白溶液(Sigma，德国)、0.9 μmol·L−1正向和反向引物、0.25 μmol·L−1探针、5 ng·μL−1 DNA 和无核酸酶灭菌水。扩增程序为50 ℃ 2 min（激活尿嘧啶-N-糖基化酶），95 ℃ 10 min（激活AmpliTaq Gold DNA 聚合酶），40 个循环（95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火延伸 1 min）。程序完成后，软件将自动分析并导出数据。
高通量qPCR检测系统由日本Takara公司开发，其自动化程度高，能够快速、高效地对目的基因进行定量，目前国内已经进行市场化，SmartChip 纳升芯片的到货周期也较短，一般为1—2周。该系统特别适合用于大量样品的快速检测，在环境研究领域已逐步引起重视，具有广泛的应用价值与前景。
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数据统计：高通量qPCR导出的数据扩增效率需在90%—110% 之间，熔解曲线有多个峰或扩增效率超出可接受范围的放弃反应。循环临界值(Cycle threshold，CT)设定为29，3个技术重复中基因的检测结果均为阳性的才可认定为检测阳性。只有当病原菌的任何一个标记基因均被检测为阳性时，才认为是真正存在的病原体。根据标准曲线计算微生物标记物的绝对丰度(copies·L−1或者copies·g−1)。
数据分析：数据使用Microsoft Excel 2016进行统计运算，用R语言2.14.0进行热图分析，用 Origin Pro9.0作图。
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本试验分别采集了两个污水处理厂（WWTP1、WWTP2）2 d的进出水样品，共计4个进水样品（WWTP1 inf-1、WWTP1 inf-2、WWTP2 inf-1、WWTP2 inf-2）、4个出水样品（WWTP1 enf-1、WWTP1 enf-2、WWTP2 enf-1、WWTP2 enf-2），污水处理厂病原微生物和粪便污染情况如图1、图2所示。
污水处理厂进水样品中共检出19个病原微生物分子标记物，靶标了13种病原微生物，包括嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、蜡样芽胞杆菌/苏云金芽孢杆菌（Bacillus cereus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、阪崎杆菌（Cronobacter spp.）、多种致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli, EPEC）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、志贺氏菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等11种胃肠道病原微生物和克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。与进水中共检测到19种病原微生物分子标记物相比，出水中只检测到10种且出水中病原微生物丰度低于进水。这是可以预测的结果，因为污水处理厂进水聚集了来源不同的各种污水、粪便，如生活污水、医院废水等，这些环境富含有机质和大量病原菌。经过污水处理过程，有机质及病原菌显著减少，因此出水检测到的病原菌数目和丰度较少。
在污水处理厂进水和出水中，克雷伯氏肺炎杆菌检出浓度均最高，其次是致病性大肠杆菌。肺炎克雷伯菌是一种常见的属于大肠菌群的病原菌，主要引起呼吸道和肠道感染。致病性大肠杆菌是世界上最常见的导致腹泻的大肠杆菌，主要导致儿童和老人腹泻[31]，可通过食物、水及接触传播。尽管污水处理可以显著降低这些病原菌的浓度，但在最终出水中依然可检测到肺炎克雷伯菌和致病性大肠杆菌，这与以前的报道一致[32]。在进出水中检测到的其它病原微生物，如金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌会引起腹泻感染；产气荚膜梭菌会感染伤口引起气性坏疽、致死率高达30%；志贺氏菌、阪岐杆菌主要通过消化道途径传播，婴幼儿更易感；铜绿假单胞菌会引发肺炎，严重时致死。值得注意的是，肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌均为革兰氏阴性菌，大多数菌株可通过产生β-内酰胺酶对碳青霉烯类耐药。这些数据表明，直接排放污水以及中水回用等可能是下游环境如海洋、土壤等环境中病原菌的来源。出水的不合理排放和使用可能会给人类带来腹泻感染的风险。另外，有研究指出，荧光定量PCR法检测的255例临床标本中，肺炎克雷伯菌的阳性检出率为32.16%，而细菌培养阳性检出率仅为27.06%[33]；与传统/常规细菌培养鉴定法相比，荧光定量PCR检测到的铜绿假单胞菌的特异性吻合率达100%且诊断时间明显缩短[34]。因此，采用阳性检出率高、检测速度快、人力花费少、特异性强且定量准确的TaqMan高通量荧光定量PCR实时监测环境中病原菌的存在，同时发展新方法新技术提高污水处理技术和检测技术，对于减少环境病原菌的污染是必要的。
污水处理厂进水样品共检出7种粪便污染分子标记物，粪便污染丰度达1.11×108 copies/100 mL。相比之下，出水样品只检测到5种粪便污染分子标记物且丰度为5.19×105 copies/100 mL。污水处理厂1和污水处理厂2进水样品分别有4、5个分子标记物能检测到人类粪便污染，且污染程度高（5.4—7.7 lg copies/100 mL）；除了污水处理厂1第二天出水样品（WWTP1 enf-2）未检出人类粪便污染，其他3个出水样品均检出人类粪便污染（4.1—5.3 lg copies /100 mL）。两个污水处理厂进水样品及污水处理厂2出水样品（WWTP2 enf-2）可能存在狗粪便污染。且在污水处理厂2进水样品检出较高的猪粪便污染（5.6—5.8 lg copies/100 mL）。这些数据表明污水处理厂中的粪便污染主要是来源于人类和动物，且人类粪便是主要污染源，而猪粪的检出可能来源于城市中养殖厂废水的排放。两个污水处理厂进出水中的总细菌含量与病原微生物、粪便污染的检出也有着相似规律，即出水中总细菌含量相对于进水而言有明显降低。对各采样点微生物检出进行PCA分析进一步证实进出水的微生物污染状况有着差异，特别是两个污水处理厂两天的进水样品均集中聚集，微生物污染状况类似，且均远离两天的出水样品，说明两者之间微生物污染差异较大（图3）。
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长期施肥土壤中检测到的病原微生物种类与含量极少（0.9—2.7 lg copies/ng DNA，图4），只检测到棘阿米巴（Acanthamoeba spp.）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）及军团菌（Legionella spp.）。其中，施加鸡粪土壤中检测到的病原菌丰度高于施加污泥土壤中检出的病原菌丰度，施加化肥土壤中检出的病原菌丰度与对照处理相差不大，并且不管是哪种施肥处理，检出的病原菌丰度均为军团杆菌最高，其次为棘阿米巴。有研究指出军团菌属中包含多种非致病菌种[35]，本研究所用的分子标记物为该菌的23S rRNA，其涵盖该菌属中的非致病菌株，因此该分子标记物可能不适于军团菌病原微生物污染的评估，后续研究将针对军团菌属中致病菌的特异基因进行优化。有报导称棘阿米巴性角膜炎爆发可能与受污染的土壤和水体有关[36]，该污染出现在与人类生活密切相关的土壤环境中，应引起重视。近年来有越来越多的研究指出，受污染土壤中的病原菌可通过植物根系、叶片等进入植物体，从而在植物体内定殖[37-40]，若定殖发生在生活中常见的果蔬，尤其是生食果蔬中，则会对人类健康造成重要危害，因此，对土壤环境中微生物污染的监测及管控必不可少。
采用高通量qPCR方法在施肥土壤中没有检测到粪便污染，且只检出少数几种病原微生物，这可能与粪肥施入时间和施肥土壤的性质有一定关系[41]，首先，病原微生物在随粪肥进入土壤后常呈现逐渐衰减的特征，其次，土壤异质性会导致土壤中微生物的不均匀分布，同时也会限制微生物的扩散，这两方面的影响可能会导致样品中病原微生物检出较少。另外，之前的研究利用传统的qPCR技术在施加了鸡粪的土壤样本中检测到低丰度的粪便输入[25]。这可能是由于每个定量孔的体积为100 nL限制了样本量，小样本量可使qPCR反应速度加快、温度均匀性好，但同时也降低了qPCR体系的检测限。已被证明在低浓度样品中，特别是环境样品中，少量qPCR体积更有可能因为缺少目标DNA而不发生扩增[42]。因此，高通量qPCR的灵敏度还是存在一些挑战。
本研究也对病原菌和粪便污染相关基因的相关性进行讨论分析。首先，粪便污染指示菌的检出表明环境受到了相应宿主粪便的污染，可间接反映该环境可能有病原菌的污染，因为粪便一般携带较多的人类或动物病原菌。但是由于病原菌种类繁多，高丰度粪便菌的检出不一定代表着有高丰度病原菌的存在。此外病原菌的检出也只能间接反映该环境受到粪便污染，但病原菌检出丰度的高低并不能反映粪便污染的严重程度，因为病原菌丰度的高低也与温度、有机质等多种环境因子相关。
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本研究利用高通量qPCR检测技术对污水处理厂、施肥土壤中微生物污染状况进行了常见病原微生物和粪便污染源（人类、反刍动物、家禽、猪、狗）的检测，用以评估这些环境中微生物污染状况。在这些复杂的环境样品中均能检测到微生物污染。其中，污水处理厂进水检测出的微生物污染种类和丰度最高，污染状况最严重，共检出了人类、猪、狗粪便污染和13种病原微生物；而出水中只检测到7种病原微生物，说明城市污水处理厂成为环境微生物重要的污染汇，污水处理设施虽可去除污水中部分微生物污染，但仍有相当数量的粪便污染与病原微生物污染可能排放到自然水体中，成为其他环境中的微生物污染源，污水处理厂微生物污染问题应引起重视。同样的方法在施肥土壤中没有检测到粪便污染，且只检出少数几种病原微生物，而检测限较低的常规PCR法检测到存在家禽粪便污染，这可能与粪肥施入时间、施肥土壤性质及高通量PCR的灵敏度有一定关系。因此，后续研究可根据样品自身特性选择合适的方法进行检测，同时应针对致病菌和常见粪便污染源的特异基因进行优化，以实现用高通量qPCR检测技术更科学准确、大量、快速地监控这些环境中的微生物污染状况，为环境微生物污染监管与控制提供有效依据。
高通量定量PCR研究环境中的微生物污染特征
Tracking microbial contaminants in environments by high-throughput quantitative PCR
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摘要: 微生物污染(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫)会引起多种传染病和寄生虫病，对环境安全和人体健康造成重要威胁。本研究利用可同时检测33种病原微生物以及10种不同粪便污染源的基于TaqMan探针的高通量qPCR检测技术，对污水处理厂进出水、长期施加有机肥（污泥或鸡粪）或化肥土壤中的微生物污染状况进行了研究。结果表明，污水处理厂中检测出的微生物污染种类和丰度较高，污染状况较严重，土壤环境微生物污染较小。在污水处理厂中，共检出13种人类病原微生物，进水中检测到的病原菌数目和丰度高于出水，其中，克雷伯氏肺炎杆菌和致病性大肠杆菌在污水处理厂进出水具有最高丰度，并发现污水处理厂中具有人类、猪、狗粪便污染；土壤中共检出3种病原菌，其中军团杆菌和棘阿米巴检测丰度最高，有机肥（污泥或鸡粪）施用显著增加土壤中病原菌丰度，同时发现这些土壤中存在家禽粪便污染。研究表明，污水处理设施虽可去除污水中部分微生物污染，但仍有相当数量的微生物污染可能排放到自然水体中，成为下游环境如土壤等中的微生物污染源，进而影响人类健康。Abstract: Microbial contamination, including pathogenic bacteria, fungi, viruses and parasites, can cause a variety of infectious and parasitic diseases, threatening environmental safety and human health. In this study, a TaqMan-based high-throughput qPCR approach, which could simultaneously quantify 33 human pathogens and 10 different sources of fecal pollution, was applied to investigate the microbial contamination in the influent and effluent of wastewater treatment plants (WWTPs) and the long-term fertilizer-applied soils (sludge, chicken manure, and chemical fertilizers). The results showed that the number and abundance of microbial contaminations in WWTP samples were higher, and the soil microbial pollution was less. A total of 13 human pathogens were detected in WWTPs, and influent harbored higher number of and more abundant pathogens than those in effluent. Klebsiella pneumoniae and enteropathogenic Escherichia coli were the dominant pathogens in WWTPs. The fecal pollutions from human, pig and dog were the main source of microbial contaminations in WWTPs. Soils were detected with three pathogens, of which Legionella spp. and Acanthamoeba spp. were predominant. The application of organic fertilizers (sewage sludge or chicken manure) significantly increased the abundance of pathogens. Livestock manure was the main pollution source of these fertilized soils. These data suggested that there is still a considerable amount of microbial contaminants in the effluent of WWTPs, despite sewage treatment facilities could remove a majority of microbial pollution in the sewage. These persistent microbial contaminants can serve as potential pollution source for the downstream environments, posing a potential health risk.
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图 1 污水处理厂病原微生物丰度（lg copies/100 mL）
Figure 1. Abundance of pathogenic microorganisms in the inlet and outlet water of WWTP(lg copies/100mL）
图 2 污水处理厂进出水粪便污染丰度（lg copies/100 mL）
Figure 2. Abundance of fecal pollution in the inlet and outlet water of WWTP(lg copies/100 mL）
图 3 采样点微生物污染状况PCA图
Figure 3. Principal component analysis of microbial contamination in sampling sites
图 4 污水处理厂与施肥土壤病原微生物丰度比较（lg copies/ng DNA）
Figure 4. Comparison of the abundance of pathogenic microorganisms in WWTP and fertilization soils(lg copies/ng DNA）
处理组
Treatment污泥/(t·hm−2)
Sewage sludge鸡粪/(t·hm−2)
Chicken manure尿素/(kg·hm−2)
Urea过磷酸盐/(kg·hm−2)
Superphosphate硫酸钾/(kg·hm−2)
Potassium sulphateCK 0 0 0.00 600 240 0.5N 0 0 65.25 600 240 1N 0 0 130.50 600 240 0.5SS 4.5 0 65.25 600 240 1SS 9 0 65.25 600 240 2SS 18 0 65.25 600 240 4SS 36 0 65.25 600 240 1CM 0 10 65.25 600 240 
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病原微生物
Pathogens指示基因
Gene target基因功能
Gene function引物与探针序列（5'-3'，正向引物F，反向引物R，探针P）
Primes and probes (5'-3', F-forward primer;
R-reverse primer; P-TaqMan probe)Campylobacter jejuni/ C. coli cadF 结合蛋白
fibronectin-binding proteinF, CTGCTAAACCATAGAAATAAAATTTCTCAC；
R, CTTTGAAGGTAATTTAGATATGGATAATCGP, FAM-CATTTTGACGATTTTTGGCTTGA-MGB-NFQ Campylobacter jejuni mapA 膜相关蛋白
membrane-associated proteinF, CTGGTGGTTTTGAAGCAAAGATT；
R, CAATACCAGTGTCTAAAGTGCGTTTATP, FAM-TTGAATTCCAACATCGCTAATGTATAAAAGCCCTTT-BHQ1 hipO 马尿酸酶
hippuricaseF, TCCAAAATCCTCACTTGCCATT；
R, TGCACCAGTGACTATGAATAACGAP, FAM-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCCACAGCT-BHQ1 Campylobacter coli ceuE 周质底物结合蛋白
periplasmic substrate binding proteinF, AAGCTCTTATTGTTCTAACCAATTCTAACA；
R, TCATCCACAGCATTGATTCCTAAP, FAM-TTGGACCTCAATCTCGCTTTGGAATCATT-BHQ1 cdtA 胀毒素
cytolethal distending toxinF, TGTCAAACAAAAAACACCAAGCTT；
R, CCTTTGACGGCATTATCTCCTTP, FAM-AAAATTTCCCGCCATACCACTTGTCCC-BHQ1 Campylobacter lari pepT 肽酶
peptidaseF, TTAGATTGTTGTGAAATAGGCGAGTT；
R, TGAGCTGATTTGCCTATAAATTCGP, FAM-TGAAAATTGGAACGCAGGTG-MGB-NFQ Vibrio cholera/V. parahaemolyticus toxR 毒素
toxinF, GTTTGGCGAGAGCAAGGTTT；
R, TCTCTTCTTCAACCGTTTCCAP, FAM-CGCAGAGTCGAAATGGCTTGG-MGB-NFQ Vibrio cholerae ctxA 霍乱毒素 A
cholera toxin AF, TTTGTTAGGCACGATGATGGAT；
R, ACCAGACAATATAGTTTGACCCACTAAGP, FAM-TGTTTCCACCTCAATTAGTTTGAGAAGTGCCC-BHQ1 total Vibrio cholerae ompW 外膜蛋白 W
outer membrane
protein WF1, AAGCTCCGCTCCTGTATTTGC；F2, ACTAGCCGCTCCTGTATTTGC R, GCTATTAACTGCCAACTCACTTTGAG；P, FAM-CACCAAGAAGGTGACTTT-MGB-NFQ Toxigenic Vibrio cholerae ctxA 霍乱毒素 A
cholera toxin AF, GCATAGAGCTTGGAGGGAAGAG；
R, CATCGATGATCTTGGAGCATTCP, FAM-CATCATGCACCGCCG-MGB-NFQ Clostridium perfringens cpe 肠毒素
enterotoxinF, AACTATAGGAGAACAAAATACAATAG；
R, TGCATAAACCTTATAATATACATATTCP, FAM-TCTGTATCTACAACTGCTGGTCCA-BHQ1 cpa α 毒素
α toxinF, AAAAGAAAGATTTGTAAGGCGCTTAT；
R, CCCAAGCGTAGACTTTAGTTGATGP, FAM-TGCCGCGCTAGCAACTAGCCTATGG-BHQ1 plc α 毒素
α toxinF, GCATGAGTCATAGTTGGGATGATT；
R, CCTGCTGTTCCTTTTTGAGAGTTAGP, FAM-TGCAGCAAAGGTAACTT-MGB-NFQ Salmonella enterica invA 侵袭蛋白
invasion proteinF, GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；
R, CCCAAGCGTAGACTTTAGTTGATGP, FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG-BHQ1 Salmonella invA-Sal 侵袭蛋白
invasion proteinF, CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATT；
R, TCATCGCACCGTCAAAGGAACCP, FAM-CCACGCTCTTTCGTCT-MGB-NFQ invA 侵袭蛋白
invasion proteinF, TCGGGCAATTCGTTATTGG；
R, GATAAACTGGACCACGGTGACAP, FAM-AAGACAACAAAACCCACCGC-MGB-NFQ Listeria monocytogenes Listeriolysin O 毒力因子
virulence factorF, TGCAAGTCCTAAGACGCCA；
R, CACTGCATCTCCGTGGTATACTAAP, FAM-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-BHQ1 iap 入侵相关蛋白p60 F, AGTGCTATTATTGCTGAAGCTCAAAA；
R, TCCGTTACCACCCCATGAATinvasion associated protein p60 P, FAM-CACCTTGGAAAAGC-MGB-NFQ hlyA 毒力因子
virulence factorF, ACTTCGGCGCAATCAGTGA；
R, TTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGCTTP, FAM-TGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGC-BHQ1 Shiga-toxigenic E. coli stx1 志贺氏毒素 1
Shiga toxin 1F, ACTTCTCGACTGCAAAGACGTATG；
R, ACAAATTATCCCCTGWGCCACTATCP, FAM-CTCTGCAATAGGTACTCCA-MGB-NFQ stx2 志贺氏毒素 2
Shiga toxin 2F, CCACATCGGTGTCTGTTATTAACC；
R, GGTCAAAACGCGCCTGATAGP, FAM-TTGCTGTGGATATACGAGG-MGB-NFQ enteropathogenic E. coli eae 黏附素
intiminF, CATTGATCAGGATTTTTCTGGTGATA；
R, CTCATGCGGAAATAGCCGTTAP, FAM-ATACTGGCGAGACTATTTCAA-MGB-NFQ bfpA 菌毛
Bundle-forming piliF, TGGTGCTTGCGCTTGCT；
R, CGTTGCGCTCATTACTTCTGP, FAM-CAGTCTGCGTCTGATTCCAA-MGB-NFQ enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 stx1 志贺氏毒素 1
Shiga toxin 1F, GACTGCAAAGACGTATGTAGATTCG；
R, ATCTATCCCTCTGACATCAACTGCP, FAM-TGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTC-BHQ1 stx2 志贺氏毒素 2
Shiga toxin 2F, ATTAACCACACCCCACCG；
R, GTCATGGAAACCGTTGTCACP, FAM-CAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTG-BHQ1 eae 黏附素
intiminF, GTAAGTTACACTATAAAAGCACCGTCG；
R, TCTGTGTGGATGGTAATAAATTTTTGP, FAM-AAATGGACATAGCATCAGCATAATAGGCTTGCT-BHQ1 enteroaggregative E. coli aaiC VI 型分泌系统
type VI secretion systemF, ATTGTCCTCAGGCATTTCAC；
R, ACGACACCCCTGATAAACAAP, FAM-TAGTGCATACTCATCATTTAAG-MGB-NFQ aatA 转运蛋白
antiaggregation protein transporterF, CTGGCGAAAGACTGTATCAT；
R, TTTTGCTTCATAAGCCGATAGAP, FAM-TGGTTCTCATCTATTACAGACAGC-MGB-NFQ enterotoxigenic E. coli elt 热不稳定肠毒素
heat-labile enterotoxinF, TTCCCACCGGATCACCAA；
R, CAACCTTGTGGTGCATGATGAP, FAM-CTTGGAGAGAAGAACCCT-MGB-NFQ Shigella spp. ipaH 侵袭性质粒抗原 H
invasion plasmid antigen HF, CCTTTTCCGCGTTCCTTGA；
R, CGGAATCCGGAGGTATTGCP, FAM-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-BHQ1 Shigella spp. ipaH-Shig1 侵袭性质粒抗原 H
invasion plasmid antigen HF, CTTGACCGCCTTTCCGATA；
R, AGCGAAAGACTGCTGTCGAAGP, FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-BHQ1 Giardia lamblia β-Giardin P434 (P1) β-贾第虫素 A
β-Giardin gene assemblage AF, CCTCAAGAGCCTGAACGATCTC；
R, AGCTGGTCGTACATCTTCTTCCTTP, FAM-TTCTCCGTGGCAATGCCCGTCT-BHQ1 β-Giardin P434 (H3) β-贾第虫素 B
β-Giardin gene assemblage BF, CCTCAAGAGCCTGAACGACCTC；
R, AGCTGGTCATACATCTTCTTCCTCP, FAM-TTCTCCGTGGCGATGCCTGTCT-BHQ1 β-Giardin P241 β-贾第虫素
β-GiardinF, CATCCGCGAGGAGGTCAA；
R, GCAGCCATGGTGTCGATCTP, FAM-AAGTCCGCCGACAACATGTACCTAACGA-BHQ1 18S rRNA 18S 核糖体基因
18S rRNAF, GACGGCTCAGGACAACGGTT；
R, TTGCCAGCGGTGTCCGP, FAM-CCCGCGGCGGTCCCTGCTAG-BHQ1 Cryptosporidium parvum COWP 半胱氨酸蛋白酶抑制因子
oocystatinF, CAAATTGATACCGTTTGTCCTTCTG；
R, GGCATGTCGATTCTAATTCAGCTP, FAM-TGCCATACATTGTTGTCCTGACAAATTGAAT-BHQ1 Cryptosporidium species
human-pathogenic18S rRNA 18S 核糖体基因
18S rRNAF, GGGTTGTATTTATTAGATAAAGAACCA；
R, AGGCCAATACCCTACCGTCTP, FAM-TGACATATCATTCAAGTTTCTGAC-MGB-NFQ Entamoeba histolytica 18S rRNA 18S 核糖体基因
18S rRNAF, ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA；
R, GCGGACGGCTCATTATAACAP, FAM-TCATTGAATGAATTGGCCATTT-MGB-NFQ Aeromonas hydrophilia aha1 黏附素
adherence factorsF, ACCGCTGCTCATTACTCTGATG；
R, CCAACCCAGACGGGAAGAAP, FAM-TGATGGTGAGCTGGTTG-MGB-NFQ Bacillus cereus/B. thuringiensis bceT 肠毒素
enterotoxinF, AATTACATTACCAGGACGTGCTTACTT；
R, TCCAAGCTGATTGGAATAGTTCATAAP, FAM-CAAGTTGGGAATAATG-MGB-NFQ Helicobacter pylori vacA 空泡毒素
vacuolating cytotoxinF, GAATTCCCTAACAAGGAATACGACTT；
R, CCAATCCCAACCTCCATCAAP, FAM-ACAGATCCCTTTTATCC-MGB-NFQ urea 脲酶亚基 α
urease subunit αF, CGTGGCAAGCATGATCCAT；
R, GGGTATGCACGGTTACGAGTTTP, FAM-TCAGGAAACATCGCTTCAATACCCACTT-BHQ1 16S rRNA 16S 核糖体基因
16S rRNAF, CTCATTGCGAAGGCGACCT；
R, TCTAATCCTGTTTGCTCCCCAP, FAM-ATTACTGACGCTGATTGCGCGAAAGC-BHQ1 Clostridium difficile tcdB 毒素 B
toxin BF, GGTATTACCTAATGCTCCAAATAG；
R, TTTGTGCCATCATTTTCTAAGCP, FAM-CCTGGTGTCCATCCTGTTTC-MGB-NFQ cdtA 胀毒素 A
cytolethal distending toxin AF, GATCTGGTCCTCAAGAATTTGGTT；
R, GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTP, FAM-AACTCTTACTTCCCCTGAAT-MGB-NFQ cdtB 胀毒素 B
cytolethal distending toxin BF, AAAAGCTTCAGGTTCTTTTGACAAG；
R, TGATCAGTAGAGGCATGTTCATTTGP, FAM-CAAGAGATCCGTTAGTTGCAGCATATCCAATTGT-BHQ1 tcdA 毒素 A
toxin AF, CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT；
R, AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGCP, FAM-TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG-BHQ1 Cronobacter spp. ITS G 操纵子
G operonF, CCGGAACAAGCTGAAAATTGA；
R, TCTTCGTGCTGCGAGTTTGP, FAM-ACTCTGACACACCGCGCATTCCTG-BHQ1 MMS 大分子合成操纵子
macromolecular synthesis operonF, GGGATATTGTCCCCTGAAACAG；
R, CGAGAATAAGCCGCGCATTP, FAM-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ1 Legionella pneumophila mip 巨噬细胞感染增强基因
macrophage infectivity potentiatorF, AAAGGCATGCAAGACGCTATG；
R, GAAACTTGTTAAGAACGTCTTTCATTTGP, FAM-TGGCGCTCAATTGGCTTTAACCGA-BHQ1 mip-Lpne 巨噬细胞感染增强基因
macrophage infectivity potentiatorF, ACCGATGCCACATCATTAGCT；
R, CCAAATCGGCACCAATGCP, FAM-CAGACAAGGATAAGTTGTC-MGB-NFQ Staphylococcus aureus sec 肠毒素 C
enterotoxin CF, CGTATTAGCAGAGAGCCAACCA；
R, GTGAATTTACTCGCTTTGTGCAAP, FAM-ACCCTACGCCAGATGA-MGB-NFQ nuc 热稳定性核酸酶
thermostable nucleaseF, CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTAACTTTAGTTG；
R, TGCACTATATACTGTTGGATCTTCAGAAP, FAM-TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-BHQ1 tufa 翻译延长因子
translation elongation factorF, CATGGTTGACGATGAAGAATTATTAGA；
R, TGGGAAGTCATATTCGCTTAATAAGTCP, FAM-AGTAGAAATGGAAGTTCG-MGB-NFQ Pseudomonas aeruginosa ecfX 胞质外σ功能因子
extracytoplasmic function σ factorF, CGCATGCCTATCAGGCGTT；
R, GAACTGCCCAGGTGCTTGCP, FAM-ATGGCGAGTTGCTGCGCTTCCT-BHQ1 gyrB DNA旋转酶亚基 B
DNA gyrase subunit BF, CCTGACCATCCGTCGCCACAAC；
R, CGCAGCAGGATGCCGACGCCP, FAM-CCGTGGTGGTAGACCTGTTCCCAGACC-BHQ1 regA 外毒素A调节剂
regulator for exotoxin AF, TGCTGGTGGCACAGGACAT；
R, TTGTTGGTGCAGTTCCTCATTGP, FAM-CAGATGCTTTGCCTCAA-MGB-NFQ Mycobacterium tuberculosis IS6110 插入序列 6110
insertion sequence 6110F, AGACGTTATCCACCATAC；
R, AGTGCATTGTCATAGGAGP, FAM-TCTCAGTACACATCGATCCGGT-BHQ1 IS6110-p 插入序列 6110
insertion sequence 6110F, CCGAGGCAGGCATCCA；
R, GATCGTCTCGGCTAGTGCATTP, FAM-TCGGAAGCTCCTATGAC-MGB-NFQ Leptospira spp. lipL32 脂蛋白
lipoproteinF, AAGCATTACCGCTTGTGGTG；
R, GAACTCCCATTTCAGCGATTP, FAM-AAAGCCAGGACAAGCGCCG-BHQ1 Streptococcus pneumoniae lytA 自融素
autocytolysinF, ACGCAATCTAGCAGATGAAGC；
R, TGTTTGGTTGGTTATTCGTGCP, FAM-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG-BHQ1 lytA-CDC 自融素
autocytolysinF, ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA；
R, TCGTGCGTTTTAATTCCAGCTP, FAM-GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ1 psaA 肺炎球菌表面黏附
pneumococcal surface adhesionF, GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA；
R, GACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCGP, FAM-CTAGCACATGCTACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA-BHQ1 cpsA 荚膜多糖生物合成
capsular polysaccharide biosynthesisF, GCTGTTTTAGCAGATAGTGAGATCGA；
R, TCCCAGTCGGTGCTGTCAP, FAM-AATGTTACGCAACTGACGAG-MGB-NFQ Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis IS900 插入序列 900
insertion sequence 900F, AATGACGGTTACGGAGGTGGT；
R, GCAGTAATGGTCGGCCTTACCP, FAM-TCCACGCCCGCCCAGACAGGTTG-BHQ1 Acanthamoeba spp. 18S rRNA 18S 核糖体基因
18S rRNAF, CGACCAGCGATTAGGAGACG；
R, CCGACGCCAAGGACGACP, FAM-TGAATACAAAACACCACCATCGGCGC-BHQ1 Klebsiella pneumoniae phoE 外膜磷酸孔蛋白
outer membrane phosphate porinF, CCTGGATCTGACCCTGCAGTA；
R, CCGTCGCCGTTCTGTTTCP, FAM-CAGGGTAAAAACGAAGGC-MGB-NFQ Neisseria gonorrhoeae opa 混浊蛋白
opacity proteinF, GTTGAAACACCGCCCGG；
R, CGGTTTGACCGGTTAAAAAAAGATP, FAM-CCCTTCAACATCAGTGAAA-MGB-NFQ
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宿主
Hosts标记物名称
Markers指示基因
Gene target引物与探针序列（5'-3'方向，正向引物F，反向引物R，探针P）
Primer and probe sequences(5'-3'; F-forward primer;
R-reverse primer; P-TaqMan probe)细菌
BacteriaBact2 细菌通用16S核糖体基因
16S rRNA gene for universal bacteriaF, CGGTGAATACGTTCCCGG;
R, TACGGCTACCTTGTTACGACTT;P, FAM-CTTGTACACACCGCCCGTC-MGB-NFQ 人
HumanHuman mtCytb 线粒体细胞色素b
Mitochondrial cytochrome bF, AGTCCCACCCTCACACGATTCTTT；
R, AGTAAGCCGAGGGCGTCTTTGATT;P, FAM-ACCCTTCATTATTGCAGCCCTAGCAGCACT-BHQ1 HumM2 脆弱拟杆菌假想蛋白BF3236，可能参与了细菌表面多糖和脂多糖的重构
Bacteroides fragilis Hypothetical protein BF3236 potentially involved in remodeling of bacterial surface polysaccharides and lipopolysaccharidesF, CGTCAGGTTTGTTTCGGTATTG；
R, TCATCACGTAACTTATTTATATGCATTAGC;P, FAM-TATCGAAAATCTCACGGATTAACTCTTGTGTACGC-BHQ1 HF183-BacR287 Bacteroides16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidesF, ATCATGAGTTCACATGTCCG；
R, CTTCCTCTCAGAACCCCTATCC;P, FAM-CTAATGGAACGCATCCC-MGB-NFQ HF183- BFDrev Bacteroides 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidesF, ATCATGAGTTCACATGTCCG；
R, CGTAGGAGTTTGGACCGTGT;P, FAM- CTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGA-BHQ1 B. fragilis gyrB Bacteroides fragilis DNA促旋酶B亚基
Bacteroides fragilis DNA gyrase B subunitF, GGCGGTCTTCCGGGTAAA；
R, CACACTTCTGCGGGTCTTTGT;P, FAM-TGGCCGACTGCTC-MGB-NFQ 家禽
PoultryChicken/duck ND5 线粒体NADH脱氢酶亚基5
Mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 5F, ACCTCCCCCAACTAGC；
R, TTGCCAATGGTTAGGCAGGAG;P, FAM-TCAACCCATGCCTTCTT-MGB-NFQ Chicken/duck cytb 线粒体细胞色素b
Mitochondrial cytochrome bF, AAATCCCACCCCCTACTAAAAATAAT；
R, CAGATGAAGAAGAATGAGGCG;P, FAM-ACAACTCCCTAATCGACCT-MGB-NFQ Av43 Firmicutes 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for FirmicutesF, GCAAGTTGAGCGGAGATATGG；
R, ATCGGCCTATCCCCCAATATA;P, FAM-CTCTTTATATTTTAGCAGCGAACG-BHQ1 Plprobe Bifidobacterium 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BifidobacteriumF, TTCGGGTTGTAAACCGCTTTT；
R, TACGTATTACCGCGGCTGCT;P, FAM-GAGAGTGAGTGTACCCGTT-MGB-NFQ 猪
PigPig-2-Bac Bacteroidales 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidalesF, GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT；
R, ACCTCATACGGTATTAATCCGC;P, FAM-TCCACGGGATAGCC-MGB-NFQ Swine mtDNA Mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 5
线粒体NADH脱氢酶亚基5F, ACAGCTGCACTACAAGCAATCC；
R, GGATGTAGTCCGAATTGAGCTGATTT;P, FAM-CATCGGAGACATTGGATTTGTCCTAT-BHQ1 牛
CowBoBac
(specifically for cow)Bacteroides 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidesF, GAAG(G/A)CTGAACCAGCCAAGTA；
R, GCTTATTCATACGGTACATACAAG;P, FAM-TGAAGGATGAAGGTTCTATGGATTGTAAACTT-BHQ1 BoBac
(specifically for ruminant)Bacteroides 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidesF, GAAG(G/A)CTGAACCAGCCAAGTA；
R, GCTTATTCATACGGTACATACAAG;P, FAM-TGAAGGATGAAGGTTCTATGGATTGTAAACTT-BHQ1 Cow mtDNA 线粒体细胞色素b
Mitochondrial cytochrome bF, GCAATACACTACACATCCGACACAA；
R, CAGATAAAAAACATTGAAGCTCCGT;P, FAM-CTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACG-BHQ1 CowM3 B. thetaiotaomicron 能量代谢和电子运输
B. thetaiotaomicron energy metabolism and electron transportF, CCTCTAATGGAAAATGGATGGTATCT；
R, CCATACTTCGCCTGCTAATACCTT;P, FAM-TTATGCATTGAGCATCGAGGCC-BHQ1 CowM2 B. fragilis 假想分泌蛋白
B. fragilis hypothetical secreted proteinF, CGGCCAAATACTCCTGATCGT；
R, GCTTGTTGCGTTCCTTGAGATAAT;P, FAM-AGGCACCTATGTCCTTTACCTCATCAACTACAGACA-BHQ1 狗
DogDog mtDNA 线粒体NADH脱氢酶亚基5
Mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 5F, GGCATGCCTTTCCTTACAGGATTC；
R, GGGATGTGGCAACGAGTGTAATTAAG;P, FAM-TCATCGAGTCCGCTAACACGTCGAAT-BHQ1 DG37 毛螺菌科
LachnospiraceaeF, TTTTCTCCCACGGTCATCTG；
R, CTTGGTTATGGGCGACATTG;P, FAM-TTGAACGTTTAAAGGAGCAGGTGGCAG-BHQ1 BacCan-UCD Bacteroidales 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidalesF, GGAGCGCAGACGGGTTTT；
R, CAATCGGAGTTCTTCGTGATATCTA;P, FAM-TGGTGTAGCGGTGAAA-MGB-NFQ DG3 Bacteroides plebeius长链脂肪酸-CoA 连接酶
long chain fatty acid-CoA ligase for Bacteroides plebeiusF, TTTTCAGCCCCGTTGTTTCG；
R, TGAGCGGGCATGGTCATATT;P, FAM-AGTCTACGCGGGCGTACT-MGB-NFQ 鸭
DuckDuck-Bac Bacteroides 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidesF, TTGGTCAATGGGCGGAAG；
R, GCACATTCCCACACGTGAGA;P, FAM-TCCTTCACGCTACTTGG-MGB-NFQ 马
HorseHorseBact-UCD Bacteroidales 16S 核糖体基因
16S rRNA gene for BacteroidalesF1, TGCGTAGGCGGGAAGTCA；
F2, AGCGCAGGCGGAGTGAT;R1, GAATTCCATCGCCCTCTAGTGT；
R2, AGTTCCGCCTTCCTCTCCC;P, FAM-CAGCCGTAAAATMGYCGG-MGB-NFQ 羊
SheepSheep mtDNA 线粒体细胞色素b
Mitochondrial cytochrome bF, GCAATACACTATACACCTGACACAA；
R, CAGATAAAAAATATTGATGCCCCGT;P, FAM-CTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGA-BHQ1 猫
CatCat mtDNA 线粒体NADH脱氢酶亚基5
Mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 5F, AACTATTCATCGGCTGAGAGGGA；
R, GCTATGATAAAGCCTACGTCTCCAATG;P, FAM-ATGCAAACACTGCCGCCCTACAAGCAAT-BHQ1
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