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Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理

高羽, 韩玮, 张桂香, 郭晓方, 吉莉, 柳丹丹. Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理[J]. 环境化学, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
引用本文: 高羽, 韩玮, 张桂香, 郭晓方, 吉莉, 柳丹丹. Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理[J]. 环境化学, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
GAO Yu, HAN Wei, ZHANG Guixiang, GUO Xiaofang, JI Li, LIU Dandan. Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
Citation: GAO Yu, HAN Wei, ZHANG Guixiang, GUO Xiaofang, JI Li, LIU Dandan. Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104

Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理

    通讯作者: Tel:13994214814,E-mail:guoxiaofang@tyust. edu. cn; 
  • 基金项目:
    山西省自然基金(20210302123204)和国家自然科学基金(42177057, 41401584)资助.

Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01

    Corresponding author: GUO Xiaofang, guoxiaofang@tyust.edu.cn
  • Fund Project: the Natural Science Foundation of Shanxi Province (20210302123204) and National Natural Science Foundation of China (42177057 , 41401584).
  • 摘要: 土壤淋洗废液处理难点在于废水中含有高浓度的稳定重金属络合物. 本研究分离了一株硫酸盐还原菌(Shewanella sp. JN01),探讨了其对模拟淋洗废液中不同络合态Cu (Cu-乙二胺四乙酸(Cu-EDTA)、Cu-谷氨酸N,N-二乙酸(Cu-GLDA)、Cu-柠檬酸(Cu-CA)和Cu-混合淋洗剂(Cu-MC))的去除效果及机理. 结果表明,活菌体和死菌体对不同络合态Cu的去除率分别大于80%和小于8%. 显然,死菌体细胞表面吸附作用对络合态Cu去除效率的贡献十分有限. 因此,Shewanella sp. JN01去除络合态Cu的主要机制是先破络,再形成CuS沉淀. Shewanella sp. JN01对不同络合态Cu的去除率为Cu-CA >Cu-MC >Cu-GLDA >Cu-EDTA,这一变化趋势与它们的稳定性常数和毒性的变化趋势相反,结果进一步证实了破络是微生物去除络合态重金属的限制性步骤. Shewanella sp. JN01能够有效去除土壤淋洗废液中重金属络合物,在淋洗废液再生利用方面具有潜在应用前景.
  • 抗生素与人们的生活息息相关,其被广泛用于防治疾病和发展养殖业[1-2]等。相对于美国每年2.3万吨的使用量和欧盟5万吨的使用量而言[3-4],我国以每年超15万吨的使用量成为全球最大的抗生素消费大国[5]。据报道,有将近60%的抗生素使用后被排放到水体环境中[6],这就使得水体受到了污染,无论是水源水[7-8]还是非水源水[9-10]都能检测到浓度为ng·L−1水平的抗生素,一些水体的检出浓度甚至达到mg·L−1水平[11]。目前,污水处理厂对水体中抗生素的处理效果并不是很理想[12-14],这些残留的抗生素会通过食物链放大作用对人体产生蓄积毒性[1, 15-16]。在众多的抗生素中,氨基糖苷类抗生素以其抗菌谱广、低成本、治疗效果好等优点而被大量使用[17-19],值得注意的是,此类抗生素的溶解性较高,导致环境受到其污染的几率大大加大。因此,非常有必要对氨基糖苷类抗生素进行毒性分析,从而为环境风险评估提供一定的数据参考。硫酸阿米卡星(Amikacin sulfate, AMI)是常用的氨基糖苷类抗生素一种,其被广泛用于临床上治疗由细菌感染的革兰氏阴性的患者。有研究表明,AMI造成肾毒性和长期耳毒性的概率为7%—62%[20]。在各类水体、牛奶、土壤和动物组织中检测到较高的残留[21],对环境的潜在危害较大,因此有必要对AMI进行毒理学研究。

    除抗生素外,作为污染物之一的重金属对环境也有较大的危害[22]。采矿、冶炼和制造等人类活动都会加剧环境中重金属的污染[23],此外,重金属具有不易降解性、持久性和生物富集等特点,这使得被重金属污染的水体对整个生态系统会产生不可逆转的损害[24]。我国约有2.8×109 m2的农业土壤被镉污染,环境中大于90%的镉污染是由于人类活动造成的[25],镉污染对人类健康存在很大的危害。生产锰的过程中约有55%的锰会排放到废水和废渣中,造成水体氨氮等指标严重超标[26],国内锰污染事件常被报道,“锰三角”也引起了较大的关注[27]。我国近20年来锌的产量是所有重金属中最多的[28],锌的点位超标率达到了0.9%[29],一些环境中锌的含量竟然能达到背景值的5倍多[28]。总之,在众多的重金属污染中,镉、锰和锌对环境造成的污染较为严重,因此有必要对这3种重金属进行毒理学研究。越来越多的研究表明,环境中的污染物都是以混合物形式存在的[30-31]。其中,在众多混合物的毒性研究中,重金属与抗生素的毒性研究较少。重金属离子会改变抗生素的生态危害,并最终影响环境污染的治理和防护,此外,人类活动又极大增加了重金属与抗生素对环境产生复合污染的机会,且硫酸阿米卡星、镉、锰和锌对环境又存在极大的危害,因此有必要探讨其混合毒性规律。

    随着混合物体系越来越复杂,使得混合污染物的毒理学评估变得越来越极具挑战性。越来越多的模型被用于评估混合物的毒性,其中最经典的两种模型是浓度加和(concentration addition, CA) 和独立作用(independent action,IA)模型[30, 32]。为了比较两种模型评估结果的差异,采用效应残差比(effect residual ratio, ERR)[33-36]来量化参考模型与实验数据的偏差,即可以定量评估混合物毒性相互作用。李孟涵等[37]采用半数效应 (E50)时的ERR值来表征拟合曲线与实测的偏离程度。Wang等[33]和Qin等[34]认为毒性作用评估需要综合考虑多个效应水平,因此,应用ERR对整个效应曲线上的毒性相互作用表征更有实际意义。

    因此,本研究以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa, C.pyrenoidosa)为受试生物,以3种重金属(五水合氯化镉(CdCl2·2.5H2O,Cd)、四水合氯化锰(MnCl2·4H2O,Mn)和七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O, Zn))和AMI为研究对象。采用均匀设计射线法(UD-Ray)[38]设计三组二元混合体系(Cd-AMI、Mn-AMI和Zn-AMI),以此研究3种重金属(Cd、Mn和Zn)与AMI的联合毒性。此外,以CA和IA模型进行毒性相互作用评估,采用ERR来比较两种模型评估结果的差异和动态表征毒性相互作用,以期为客观、准确地评估污染物的环境风险提供的方法和数据参考。

    试剂:硫酸阿米卡星(amikacin sulfate, AMI)购自上海原叶生物科技有限公司;五水合氯化镉(CdCl2·2.5H2O, Cd)、四水合氯化锰(MnCl2·4H2O, Mn)和七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O, Zn)均购自国药,均为分析纯。抗生素与重金属的理化性质均列于表1,实验所用的储备液(表1)用超纯水配制,并装于棕色瓶,保存于4 ℃的冰箱中备用。

    表 1  抗生素与重金属理化性质和储备液浓度
    Table 1.  Physical and chemical properties of antibiotic and heavy metals and concentration of stocks
    化合物Name简称Abbreviation分子式Molecular formulaCAS-RN分子量Formula weight纯度/%Purity储备液浓度/(mol·L−1)Stock solution
    硫酸阿米卡星AMIC22H43N5O13·2H2SO439831-55-5781.76≥67.41.33×10−3
    五水合氯化镉CdCdCl2·2.5H2O7790-78-5228.35≥99.01.08×10−2
    四水合氯化锰MnMnCl2·4H2O13446-34-9197.90≥99.01.58×10−3
    七水合硫酸锌ZnZnSO4·7H2O7446-20-0287.56≥99.06.68×10−2
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    主要仪器:Synery-2酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、MGC-250光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、ESJ182-4万分之一电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)、Genex系列移液器(宝予德有限公司)、721分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)等。

    蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa, C.pyrenoidosa)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB),编号为FACHB-5,培养基、培养条件和培养方法见文献[39]。

    在自然环境中,污染物常以混合物的形式存在[31],研究混合物的联合毒性可以更准确地对其环境风险进行评估。采用均匀设计射线法(UD-Ray)[38]设计抗生素与重金属的二元混合物体系(B1、B2和B3),每个体系设计均包括5条射线(R1、R2、R3、R4、R5),其设计结果见表2

    表 2  混合体系组分构成及浓度比(pi)
    Table 2.  Composition and concentration ratio (pi) of the mixture systems
    B1PCdPAMIB2PMnPAMIB3PZnPAMI
    R18.673×10−11.327×10−1R19.183×10−18.170×10−2R19.500×10−15.000×10−2
    R27.233×10−12.767×10−1R28.181×10−11.819×10−1R28.837×10−11.163×10−1
    R35.666×10−14.334×10−1R36.922×10−13.078×10−1R37.916×10−12.084×10−1
    R43.953×10−16.047×10−1R45.292×10−14.708×10−1R46.551×10−13.449×10−1
    R52.073×10−17.927×10−1R53.102×10−16.898×10−1R54.318×10−15.682×10−1
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    应用时间毒性微板分析法(t-MTA)[40]测定污染物对C.pyrenoidosa的毒性效应数据。以96孔透明微板作为实验载体,在其四周(36个微孔)加入200 μL的超纯水,以避免边缘效应。以第6、7列的12个微孔作为实验空白对照,加入100 μL的超纯水。在余下48个微孔中依次加入按预实验获得的稀释因子稀释的12个不同浓度的污染物溶液100 μL,详细过程参照文献[41]。最后在空白孔和样品处理孔中均加入100 μL事先培养至对数期的藻液(0.2<OD683<0.3),使得96个微孔内液体总体积为200 μL。以上过程重复3板。加盖,置于(25±1) ℃条件下的光照培养箱中进行培养,分别在24、48、72、96 h时,取出,用酶标仪测定OD683[42-43]。污染物对蛋白核小球藻产生的毒性效应表示为抑制率(E),计算表达式如(1)所示:

    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (1)

    为了计算任一浓度的单一物质或混合物的效应E,采用两参数模型Logit函数和Weibull函数对1.4节中获得的实验观测浓度-效应数据进行拟合[31]。通过相关系数(R)和均方根误差(RMSE)来判断函数的拟合优度[44-46],确定本实验拟合的最佳函数为Logit函数,计算公式如(2)所示。此外,数据处理均由APtox软件[40]实现。

    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (2)

    式中,α为位置参数,β为形状参数或斜率参数,c为污染物的浓度,E表示效应(0≤E≤1)。

    常采用浓度加和模型(Concentration addition, CA)和独立作用模型(Independent action, IA)[31]对混合物毒性相互作用进行分析。通过比较95%观测置信区间(OCIs)与CA、IA预测线位置来判断混合物毒性相互作用是加和作用、拮抗作用还是协同作用[22, 44, 47]。CA与IA公式如下所示:

    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (3)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (4)

    式中,m是混合物中组的个数;ci是混合物体系表现出效应x时所对应的第i个组分的浓度;ECxi是第i个组分的等效应浓度,E(Cmix)是混合物的总效应。

    有研究表明,效应残差比(Effect residual ratio, ERR)可被用来量化参考模型与实验数据的偏差[33-35],其公式如下所示:

    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (5)

    式中,EOBS为观测效应,EPRD为预测效应,x为参考模型对应的指定效应。当ERR值处于95%OCI区间内、95%OCI以上和95%OCI以下时,毒性相互作用分别为加和作用、拮抗作用和协同作用。

    AMI、Cd、Mn和Zn对蛋白核小球藻的单一毒性效应数据参见文献[48]。基于R和RMSE的数值大小[44-46],最终选用拟合效果较好的两参数非线性函数(Logit)对3种重金属(Cd、Mn和Zn)与AMI的二元混合毒性数据进行拟合。常以EC50的负对数(pEC50)为毒性大小的数值[49]图1是三组二元混合体系中射线的pEC50值在不同时间 (48、72、96 h)的雷达图。

    图 1  三组二元混合体系(AMI-Cd、AMI-Mn和AMI-Zn)的十五条射线的pEC50值在不同时间下(48、72、96 h)的雷达图
    Figure 1.  Radar graphs of pEC50 values of fifteen rays in three binary mixture systems (AMI-Cd, AMI-Mn and AMI-Zn) at different times (48, 72 and 96 h)

    图1可知,三组二元混合体系共15条射线的毒性大小均随时间的延长而变大,呈现明显的时间依赖性,且随暴露时间的延长,毒性在逐渐增大。丁婷婷等[42]发现,3种氨基糖苷类抗生素对青海弧菌和蛋白核小球藻的毒性均随时间而增大。不同混合物体系,其射线的毒性大小顺序不同,如在96 h时,AMI-Cd的5条射线的毒性大小排序为:R5>R1>R4>R2>R3;AMI-Mn的5条射线的毒性大小排序为:R1>R2>R3>R4>R5;AMI-Zn的5条射线的毒性大小排序为:R1>R2>R3>R5>R4。说明混合物组分不同及其构成比例对毒性大小有影响。刘芳等[38]在研究离子液体混合物对发光菌的毒性规律时也发现不同组分和不同组分比例对毒性均有影响。

    应用CA和IA模型进行混合毒性相互作用分析,结果见图2图3图4,其中包括实验数据点、95% OCI、浓度效应曲线(Concentration-effect curves, CRCs)和模型(CA和IA)预测线,由于在24 h时,三组混合物体系基本是加和作用没有给出。

    图 2  AMI与Cd构成的二元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用
    Figure 2.  Toxic interaction within the binary mixture of AMI and Cd on C. pyrenoidosa
    ●:实验数据点 -·-:95%置信区间线 ---:CA或IA预测线
    ●:Experimental data point -·-:95% confidence interval line ---:CA or IA prediction line
    图 3  AMI与Mn构成的二元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用
    Figure 3.  Toxic interaction wihin binary mixture of AMI and Mn on C. pyrenoidosa
    图 4  AMI与Zn构成的二元混合物对蛋白核小球藻的毒性相互作用
    Figure 4.  Toxic interaction of the binary mixture of AMI and Zn on C. pyrenoidosa

    图2图3图4可知,在三组二元混合体系中,CA和IA预测线的位置几乎都在CRCs以下。CA和IA对三组混合物体系中射线的毒性预测线除在较高浓度区域(浓度大于1E-4 mol·L−1时)略有分开外基本上是重合的,也就是说,CA和IA对三个混合物体系的毒性相互作用评估结果基本上是一致的。依据CA和IA,三组混合物体系均呈现出协同作用,且随暴露时间延长逐渐增加或减弱。如在48 h时,AMI-Cd混合物体系中5条射线的中浓度区都呈现强度不同的协同作用,在72 h时,CA和IA预测线与实验观测值偏离程度减小,呈现加和作用或弱协同作用,到了96 h,5条射线均为加和作用;在48 h时,AMI-Zn体系的5条射线在高浓度区均是协同作用,而随着时间的延长,部分射线(R2、R3、R4和R5)的高浓度区变为了加和作用,此外,每条射线在中低浓度区的加和作用在减弱而协同作用在加强,而AMI-Mn体系中R1和R2呈加和作用,R3—R5呈协同作用,且随时间的变化不明显。

    在同一个混合体系中,不同射线在不同浓度区域观察到毒性相互作用也有所差异[36, 44]。在R1到R5的过程中,AMI-Cd在中浓度区的协同作用逐渐变为加和作用;在AMI-Mn中,R1和R2的CA和IA预测线几乎都在95% OCI之内,表现为加和作用,但R3、R4和R5在中浓度区有较强的协同作用,但随暴露时间的延长变化不明显。由于R1—R5是组分浓度比不同的5条射线,毒性相互作用的不同,说明组分的浓度比影响混合物的毒性相互作用变化规律,在R1到R5的过程中,AMI-Zn中五条射线的协同作用随时间的延长逐渐趋于明显。可见,不同重金属与AMI构成的混合体系的毒性相互作用也有所不同。

    效应残差比(Effect residual ratio, ERR)可以用于检验不同效应下预测模型和CRCs的偏差[33],即可定量表征混合物的毒性相互作用。图5图6图7分别是AMI-Cd、AMI-Mn和AMI-Zn中各条射线的ERR图。

    图 5  AMI-Cd对应的ERR值
    Figure 5.  ERR values corresponding to AMI-Cd
    图 6  AMI-Mn对应的ERR值
    Figure 6.  ERR values corresponding to AMI-Mn
    图 7  AMI-Zn对应的ERR值
    Figure 7.  ERR values corresponding to AMI-Zn

    图5图6图7可看出,分别基于CA和IA的ERR值(毒性相互作用强度)随暴露时间的延长的变化趋势线基本上是重合的,但在不同的混合物体系中,毒性相互作用强度(ERR值)不同。在AMI-Cd体系中,ERR曲线随暴露时间延长逐渐靠近置信曲线下限,R5位于置信区间内,即混合物射线呈现弱协同作用且逐渐减弱。在AMI-Zn体系中,不同射线的ERR曲线随暴露时间延长ERR逐渐偏离置信区间下限,即协同作用逐渐增强。在AMI-Mn体系中,ERR曲线的曲线变化同CA和IA曲线的变化规律。与CA和IA模型相比,ERR可以在效应水平上进行毒性相互作用的定量表征[34-36]

    在AMI-Cd中,除了R1和R2在中效应区出现弱协同作用外,R3、R4和R5在整个效应下都是加和作用;在AMI-Mn中,R1在整个效应区间都表现为加和作用,而其余4条射线在中效应区间为协同作用,在低效应和高效应区间则为加和作用;在AMI-Zn中,除R1在整个效应区间内都为协同作用外,其余射线都呈现出低效应加和而中高效应协同作用的规律。这些都和CA与IA模型(图2图3图4)具有很好的一致性,但ERR法能定量评估毒性相互作用动态变化规律。

    进一步分析96 h的50%效应的毒性与组分的关系[50],发现AMI-Mn中50%效应时CA和IA对应的ERR值与组分Mn和AMI的浓度比有明显的相关关系(公式6—9);在AMI-Zn中,50%效应时CA和IA对应的ERR值与Zn的比例有正线性关系(公式10—11),而与AMI比例的正线性关系不明显(R2=0.5161);在AMI-Cd中,50%效应时CA和IA对应的ERR值与AMI和Cd组分之间均没有明显的线性关系(R2=0.0437和R2=0.3058)。

    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (6)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (7)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (8)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (9)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (10)
    stringUtils.convertMath(!{formula.content}) (11)

    (1)AMI和3种重金属(Cd、Mn和Zn)构成的二元混合体体系的毒性呈明显的时间依赖性和浓度依赖性。

    (2) CA和IA对3个二元混合物体系的预测基本一致,即3个二元混合物体系均呈现出协同作用,且协同作用有一定的时间依赖性,但AMI-Mn体系的协同作用随时间变化没有AMI-Cd和AMI-Zn的毒性相互作用变化的明显。

    (3)基于CA和IA的ERR对3个混合物体系的毒性相互作用表征结果也基本一致,但ERR可以定量的表征混合物毒性相互作用强度,且在AMI-Mn和AMI-Zn中,ERR值和组分之间存在一定的线性关系,而在AMI-Cd中ERR值与组分之间没有明显的线性关系。

  • 图 1  菌株Shewanella sp. JN01的系统发育树

    Figure 1.  The phylogenetic position of Shewanella sp. JN01

    图 2  Shewanella sp. JN01形态特征

    Figure 2.  Morphology of Shewanella sp. JN01.

    图 3  Shewanella sp. JN01对不同物质的量比的络合态Cu的去除率(a. Cu-EDTA,b. Cu-GLDA,c. Cu-CA,d. Cu-MC)

    Figure 3.  Remove efficiency of Cu in different molar ratios

    图 4  相同物质的量比下(1:10)死菌体对不同络合态Cu的吸附去除效率

    Figure 4.  Sorption removal efficiency of different Cu complexes by dead bacteria at the same molar ratio (1:10).

    图 5  不同处理中沉淀物的XRD图谱(Cu与络合剂物质的量比为1:10)

    Figure 5.  XRD patterns of precipitates from different treatments (molar ratio of Cu and complexing agent =1:10).

    图 6  不同处理中沉淀物的SEM-EDS图谱(Cu与络合剂物质的量比为1:10)

    Figure 6.  SEM-EDS image of precipitates from different treatments (molar ratio of Cu and complexing agent =1:10).

    表 1  SRB富集培养基的组成

    Table 1.  Composition of SRB enrichment medium

    药品名称Pharmaceutical ingredients质量浓度/(g·L−1)Mass concentration
    K2HPO40.5
    (NH42SO42.5
    NaHCO30.5
    CaCl20.2
    MgSO41
    乳酸钠sodium lactate20 mL·L−1
    L-抗坏血酸L-Ascorbic acid0.1
    L-半胱氨酸盐酸盐L-Cysteine hydrochloride monohydrate0.5
    酵母膏yeast extract1.5
    (NH42Fe(SO42·6H2O0.5
    药品名称Pharmaceutical ingredients质量浓度/(g·L−1)Mass concentration
    K2HPO40.5
    (NH42SO42.5
    NaHCO30.5
    CaCl20.2
    MgSO41
    乳酸钠sodium lactate20 mL·L−1
    L-抗坏血酸L-Ascorbic acid0.1
    L-半胱氨酸盐酸盐L-Cysteine hydrochloride monohydrate0.5
    酵母膏yeast extract1.5
    (NH42Fe(SO42·6H2O0.5
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    表 2  不同处理中沉淀物中的原子比(Cu与络合剂物质的量比为1:10)

    Table 2.  The atomic ratios of precipitates from different treatments (molar ratio of Cu and complexing agent =1:10).

    元素Element原子比/%Atom
    Shewanella sp. JN01Cu2+Cu-EDTACu-GLDACu-CACu-MC
    C63.3067.1378.2171.8572.0075.19
    O29.8519.4519.0316.1323.2821.69
    S6.859.071.706.643.361.57
    CuND4.341.075.381.361.56
      ND.,未检出. ND., not detected.
    元素Element原子比/%Atom
    Shewanella sp. JN01Cu2+Cu-EDTACu-GLDACu-CACu-MC
    C63.3067.1378.2171.8572.0075.19
    O29.8519.4519.0316.1323.2821.69
    S6.859.071.706.643.361.57
    CuND4.341.075.381.361.56
      ND.,未检出. ND., not detected.
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-12-31
  • 录用日期:  2022-02-25
  • 刊出日期:  2023-06-27
高羽, 韩玮, 张桂香, 郭晓方, 吉莉, 柳丹丹. Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理[J]. 环境化学, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
引用本文: 高羽, 韩玮, 张桂香, 郭晓方, 吉莉, 柳丹丹. Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理[J]. 环境化学, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
GAO Yu, HAN Wei, ZHANG Guixiang, GUO Xiaofang, JI Li, LIU Dandan. Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104
Citation: GAO Yu, HAN Wei, ZHANG Guixiang, GUO Xiaofang, JI Li, LIU Dandan. Removal efficiency and mechanism of different kinds of copper complexes from aqueous system by Shewanella sp. JN01[J]. Environmental Chemistry, 2023, 42(6): 2087-2095. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2021123104

Shewanella sp. JN01对水体系不同络合态Cu的去除效果及机理

    通讯作者: Tel:13994214814,E-mail:guoxiaofang@tyust. edu. cn; 
  • 太原科技大学环境科学与工程学院,太原,030024
基金项目:
山西省自然基金(20210302123204)和国家自然科学基金(42177057, 41401584)资助.

摘要: 土壤淋洗废液处理难点在于废水中含有高浓度的稳定重金属络合物. 本研究分离了一株硫酸盐还原菌(Shewanella sp. JN01),探讨了其对模拟淋洗废液中不同络合态Cu (Cu-乙二胺四乙酸(Cu-EDTA)、Cu-谷氨酸N,N-二乙酸(Cu-GLDA)、Cu-柠檬酸(Cu-CA)和Cu-混合淋洗剂(Cu-MC))的去除效果及机理. 结果表明,活菌体和死菌体对不同络合态Cu的去除率分别大于80%和小于8%. 显然,死菌体细胞表面吸附作用对络合态Cu去除效率的贡献十分有限. 因此,Shewanella sp. JN01去除络合态Cu的主要机制是先破络,再形成CuS沉淀. Shewanella sp. JN01对不同络合态Cu的去除率为Cu-CA >Cu-MC >Cu-GLDA >Cu-EDTA,这一变化趋势与它们的稳定性常数和毒性的变化趋势相反,结果进一步证实了破络是微生物去除络合态重金属的限制性步骤. Shewanella sp. JN01能够有效去除土壤淋洗废液中重金属络合物,在淋洗废液再生利用方面具有潜在应用前景.

English Abstract

  • 土壤重金属污染是影响人类健康和生态环境质量的世界性问题[1-2]. 固定/稳定化和直接去除是重金属污染土壤修复的两种主要方法[1,3]. 修复技术主要有固定化、玻璃化、电动修复、植物修复和化学淋洗修复[1-3]. 土壤淋洗修复技术可以将重金属转移至液相以达到永久去除土壤中重金属的目的,是一种高效、低成本的方法,尤其适用于重度污染土壤[2,4-5]. 尽管淋洗剂(乙二胺四乙酸(EDTA)、谷氨酸N, N-二乙酸(GLDA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)和柠檬酸)对土壤中重金属去除效率高,但产生大量的淋洗废液中重金属主要以稳定的络合物形式存在,在较宽的pH范围内均有较高的稳定性,易造成二次污染问题[6]. 去除络合态重金属常用的方法有化学沉淀法、化学氧化法和离子交换法,但普遍存在产泥量大、处理条件复杂、费用较高等问题[6-8]. 与传统的化学处理方法相比,生物处理具有微生物来源广泛、适应性强、成本低、效率高、对环境友好等优点而有广阔应用前景[9].

    近年来,学者们对硫酸盐还原菌(SRB)处理重金属污染废水进行了广泛的研究[9-11]. 研究表明,SRB可以去除传统废水中90%以上的Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+和Cr6+[9-11]. 一般来说,SRB去除废水中重金属离子主要通过硫化物沉淀和死菌体吸附[11-12]. 硫化物沉淀的形成过程分为两个阶段:(1)SRB利用硫酸盐作为电子受体氧化简单有机化合物生成碳酸氢根离子和硫化氢;(2)生物生成的硫化氢与游离重金属阳离子反应生成金属硫化物沉淀[9]. 此外,死菌体通过细胞壁上的官能团直接吸附重金属,有利于废水中重金属的去除[12].

    虽然SRB对传统废水中的重金属离子具有很高的去除效率,但淋洗废液中的重金属主要以络合态形式存在[7],有研究报道SRB可以通过还原反应机理有效地去除Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的络合形态[13-14],与高价态重金属相比,对于二价态重金属络合物去除的报道较少. Hakansson等[15]利用SRB产生的H2S处理络合态Pb和Cu的沉淀率达98%. 然而,据我们所知,二价重金属络合物的去除机理还不清楚. 不同络合剂如何影响SRB对络合态重金属的去除率,除形成金属硫化物沉淀外,细菌对络合态重金属的吸附效率几乎没有报道.

    为了深入了解SRB对二价态重金属络合物的去除机理,利用不同络合剂形成Cu(Ⅱ)络合物,研究了分离SRB (Shewanella sp. JN01)对不同络合态Cu的去除效果及不同途径对菌株去除Cu(Ⅱ)络合物的贡献及其机理,以期达到淋洗废液的资源化再生和无害化处理提供科学依据.

    • 采集自山西省山阴县大营村(39°22′20.12″ N, 112°52′54.69″ E)地下井挖掘过程中21 m深的土柱. 将土柱置于手套箱(Whitley DG250,英国Don Whitley Scientific)中30 ℃下厌氧培养1周. 将土柱中央的土样置于无菌水中,用稀释涂布法富集培养菌株1周. 然后用富集培养基进一步的扩大培养. 每周更换新鲜培养基,连续培养4周后获得实验菌株. 将培养基(表1)调至pH=7.2,121 ℃高压灭菌30 min. 在富集培养基中加入2%的琼脂(W/V)制备固体培养基. 将纯化后的菌株JN01按平板划线法接种在固体培养基上. 使用DNA提取试剂盒(Sangon Biotech,生工生物工程(上海)股份有限公司)提取总DNA. 采用热循环仪(Bio-Rad,C1000 Touch,美国Bio-Rad公司)进行聚合酶链反应(PCR). 用细菌通用引物从总DNA中扩增16S rRNA基因. 采用上游引物(27F 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3')和下游引物(1492R 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')扩增菌株16S rRNA基因. PCR反应体系:2×Taq PCR Master 12.5 μL,DNA模板1 μL,上游引物2 µL,下游引物2 µL,dd H2O 7.5 μL. 扩增条件:95 ℃保持5 min;95 ℃保持1 min;54 ℃保持1 min;72 ℃保持2 min;72 ℃保持10 min;30次循环. 将16S rRNA基因序列在ClustalX 2.0[16]和GenBank核酸数据库中比对. 用Mega 6.0进行邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和最大简约法(MP)分析.

    • 所用试剂参照之前的研究[17]. 以5% V/V将SRB菌液分别接种至初始pH值为7.0的培养基中,加入高浓度Cu2+、EDTA、GLDA、CA和MC储备溶液. Cu2+浓度为50 mg·L−1. n (Cu2+): n (EDTA)分别为1:0、1:1、1:5、1:10和1:25. 当物质的量比超过1:25,混合溶液将会出现体积变化较大或EDTA溶解度较低. n (Cu2+): n (GLDA、CA或MC)分别为1:0、1:1、1:5、1:10、1:25、1:50、1:75和1:100. 处理1、3、5、7 d后,测定溶液中Cu2+浓度. 所有处理设置3组平行,并做空白对照.

      死菌体吸附实验将厌氧培养24 h后的SRB悬浮液在121 ℃下灭菌30 min,然后混匀分装至装有不同络合态Cu溶液(C (Cu2+)=50 mg·L−1n (Cu2+):n (络合剂)=1:10)的锥形瓶中,pH调至5.5. 于0、0.17、0.5、1、2、4、8、20 h后取样,测定溶液中Cu2+浓度. 所有处理设置3组平行,并做空白对照.

    • 采用火焰原子吸收光谱仪(AAS,Z-2300,日本Hitachi)测定样品中Cu浓度;扫描电子显微镜(SEM-EDS,S-3400 N,日本Hitachi)和X射线衍射仪(XRD,Empyrean,荷兰PANalytical)对Shewanella sp. JN01处理不同络合态Cu的沉淀物进行表征.

    • 采用Excel、SPSS 22.0和Origin 2018进行数据整理、统计分析及作图. 采用Duncan检验确定各处理之间的统计学差异(α = 0.05).

    • SRB与希瓦氏菌16S rDNA基因序列同源性达99%,构建系统发育树如图1所示,因此,分离菌株命名为Shewanella sp. JN01. Shewanella sp. JN01菌落形态在固体培养基上边缘规则,光滑圆润,中间呈凸起的黑色菌落(图2). Shewanella sp. JN01的SEM图表明,菌体为杆状、质地略光滑,聚集较多,宽×长约为0.5 μm×(2—5) μm(图2).

    • Shewanella sp. JN01对水溶液中不同络合态Cu (Cu-EDTA、Cu-GLDA、Cu-CA和Cu-MC)的去除率与反应时间、络合剂类型和Cu与络合剂的物质的量比有关(图3). 不同物质的量比下,Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率均低于Cu2+ (1:0)的去除率(图3). 与 Cu-EDTA 和 Cu-GLDA相比,游离Cu2+更易与H2S反应形成金属硫化物沉淀,并被细菌细胞活性成分吸附[18]. 在物质的量比较低的情况下(n (Cu2+): n (EDTA/GLDA)=1:1—1:10),Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的最佳去除率一般在90%以上. 但是,随着EDTA与GLDA物质的量比增加(除n (Cu2+): n (GLDA)=1:25外),Shewanella sp. JN01对Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率显著降低至10%以下. 溶液中大量游离的EDTA和GLDA对Shewanella sp. JN01的毒性大于其络合形态,因为络合剂可通过抑制酶活性和改变细胞膜渗透压导致细胞死亡[19]. 此外,在Cu-EDTA和Cu-GLDA溶液中,EDTA和GLDA能抑制硫化物沉淀的形成,降低Cu2+的去除率[19-20]. 当n (Cu2+): n (EDTA/GLDA)=1:25时,Shewanella sp. JN01对Cu-GLDA的去除率为64.07%,而对Cu-EDTA的去除率小于10%,这可能是由于GLDA对微生物的毒性小于EDTA[5,21]. 同时,Cu-GLDA的稳定性(lg KCu-GLDA=13.03)低于Cu-EDTA(lg KCu-EDTA=18.80),表明Shewanella sp. JN01更易破络Cu-GLDA生成CuS沉淀[6,21].

      Cu-CA的去除率随CA物质的量比的增加而变化,与Cu-EDTA和Cu-GLDA的去除率差异显著. 当n (Cu2+):n (CA)为1:1—1:25时,Cu-CA的最佳去除率由83.83%提高到99.11%. 随着CA物质的量比的进一步增加,Cu-CA的去除率由不足10%显著提高到97%以上,并保持相对稳定. 在CA的高物质的量比条件下,Shewanella sp. JN01对Cu-CA的高去除效率的延迟可能是由于CA浓度过高,Shewanella sp. JN01需要时间来适应其环境[18]. 与EDTA和GLDA不同,过量的CA并不会对Cu-CA的去除产生负面影响. 这很可能是由于Shewanella sp. JN01以CA为碳源,促进Shewanella sp. JN01的生长,从而去除Cu-CA[13].

      Shewanella sp. JN01对Cu-MC的最佳去除率明显低于其他络合态Cu. 当n (Cu2+): n (MC)= 1:1—1:25时,Shewanella sp. JN01对Cu-MC的最佳去除率由85.50%降至69.40%. 当n (Cu2+): n (MC)= 1:50时,络合态Cu的去除率先显著升高后降低,5 d后Cu-MC的去除率为0. 这可能与Shewanella sp. JN01死后释放Cu有关. 尽管CA对Shewanella sp. JN01的生长没有明显抑制作用,但MC中的EDTA和GLDA会破坏其细胞结构的完整性[19]. Cu-CA在物质的量比为1:25和1:50时的去除率高于Cu-EDTA和Cu-GLDA,这说明MC对Shewanella sp. JN01的毒性作用低于EDTA和GLDA.

      Cu与络合剂物质的量比较低时,Cu-GLDA和Cu-CA在3 d后的去除率下降,主要是受Cu和络合剂的胁迫所致. Shewanella sp. JN01细胞表面活性成分受损,导致累积的Cu再次释放[22]. 此外,细胞表面附着的硫化物沉淀,由于传质阻力增加,对菌株的代谢产生不利影响[23].

      在一定的Cu与络合剂的物质的量比下,第7天的去除率基本稳定,Shewanella sp. JN01对不同络合态Cu的去除率为Cu-CA > Cu-MC > Cu-GLDA > Cu-EDTA. 这主要与他们的稳定常数有关,其稳定性为lg KCu-EDTA(18.80) > lg KCu-GLDA(13.03) > lg KCu-CA(5.95)[6,21,24]. 络合态Cu稳定越高,Shewanella sp. JN01破络难度越大,去除效果越差[15,18]. 结果表明,Cu-CA的去除率最高,尤其是在络合剂的物质的量比较高时. 与GLDA和EDTA相比,CA对菌株生长代谢和硫酸盐还原途径的抑制作用较小[13-14]. 此外,CA是小分子、可降解的络合剂,为微生物生长提供碳源[13,18]. 这进一步说明,MC对Shewanella sp. JN01的毒性较EDTA和GLDA温和,是因为MC中减少了EDTA和GLDA的用量,CA所占比例较大.

    • 死菌体对络合态Cu的最佳去除率低于游离Cu2+图4). 死菌体对Cu2+的吸附率缓慢增加,20 h后达到8.92%. 死菌体对Cu2+的去除主要是由于Cu2+直接吸附在细胞壁上[18]. 高压灭菌后,许多带负电荷的官能团(如羟基、氨基或羧基)暴露在菌体表面,增加了对带正电荷离子如Cu2+的结合位点[22].

      Shewanella sp. JN01对络合态Cu的吸附去除率趋势与Cu2+明显不同(图4). 对于络合态Cu,死Shewanella sp. JN01对Cu-CA的吸附率在1 h内迅速增加,之后基本保持不变. 死菌体对Cu-CA的吸附去除率高达7.99%,与Cu2+的吸附率相当(P > 0.05). 这是因为CA是易降解的有机物,对细菌表面损害较小[13,18]. Cu-CA主要以CuL (H3L代表柠檬酸)的形式存在,通过静电吸引与氨基结合[24-25]. 死菌体对Cu-GLDA的吸附率在1 h内达到最佳值(5.65%),随后逐渐下降后平稳;对Cu-EDTA的吸附率仅为0.44%;对Cu-MC的吸附率介于两者之间. Cu-EDTA的吸附去除率较差,这是由于Cu-EDTA在pH=5.5时主要以CuEDTA2-形式存在[6],CuEDTA2-络合物为六配位八面体结构,Cu2+被包裹于络合物内部,无法与吸附位点接触[26-27]. Cu-GLDA的吸附去除率高于Cu-EDTA,这是因为Cu-GLDA对死菌细胞的结合亲和力强[28].

      Cu-EDTA和Cu-GLDA的吸附去除率达到最佳后下降,很可能是EDTA和GLDA的毒性作用使细胞壁破坏,导致吸附的络合态铜又释放回水溶液中[19,22]. 相比而言,络合态Cu经过破络后形成硫化物沉淀的途径去除率高(> 80%,图3),死菌体对络合态Cu的吸附去除率只占Shewanella sp. JN01对络合态Cu总去除率的一小部分(< 8%,图4).

    • 考虑到Shewanella sp. JN01去除络合态Cu的主要途径是先破络进而形成硫化物沉淀,实验收集并表征了Shewanella sp. JN01处理含Cu络合物水溶液后的沉淀. XRD衍射仪分析了所得沉淀物的晶体结构(图5). 沉淀物的无定型(2θ值为20°)很可能是由于菌体细胞中多糖、蛋白质和脂质的存在[12]. 在2θ值为28.68°、47.71°和56.62°处有较强的衍射峰,对照CuS标准图谱(PDF No.89-2073)中的(111)、(220)和(311)晶面. Shewanella sp. JN01只在47.71°处有微弱的峰. 然而,Cu2+处理后的沉淀物在28.68°和47.71°处的峰强度低于络合态铜,这可能是细菌在Cu2+处理过程中产生的硫化铜颗粒较小[15]. 此外,在金属离子的胁迫下,菌株分泌的代谢物能吸附铜离子并与铜离子络合,阻碍了结晶度高的硫化铜的形成[29]. 尽管培养基中存在磷酸盐,但对Cu的沉淀影响较小. 一方面,每个处理组接菌量均为5%,因此,每个实验组的磷酸盐含量相同;另一方面,磷酸根的浓度远远低于硫酸根(表1). 在XRD衍射图中也未检出Cu的磷酸盐沉淀物. 因此,培养基中磷酸盐对不同处理组Cu沉淀差异的影响很小.

      SEM图像进一步证实了Shewanella sp. JN01处理不同络合态Cu溶液后存在沉淀颗粒[12]. EDS结果表明,沉淀物中存在Cu和S,不同处理的Cu和S的含量变化较大(图6).

      Shewanella sp. JN01沉淀物中O和S的原子比分别为29.85%和6.85%,其中未检测到Cu的含量. 加Cu2+处理后的沉淀物中O的原子比降低到19.45%,S和Cu的含量增加到9.07%和4.34%. 其中O的原子比下降很可能是由于Cu2+抑制了Shewanella sp. JN01的生长,因为沉淀物中O主要来自菌株的生长. S和Cu原子比的增加是由于加入CuSO4后,Shewanella sp. JN01在氧化还原反应中生成了CuS. 不同络合态Cu处理后的沉淀物中O、S和Cu的原子比分别为16.13%—23.28%、1.57%—6.64%和1.07%—5.38% (表2). O的含量与细菌活性密切相关,这在一定程度上可以解释菌株对Cu的去除效率随细菌活性的降低而降低[18]. 与其他Cu络合物相比,Cu-CA处理后的沉淀物中O原子比最高,说明柠檬酸可以作为碳源,提高细菌的代谢活性,从而产生更多的H2S,对Cu络合物去除率更高. 由于Cu和S的化学计量比为1:1,但S的原子比略高于Cu,这一结果很可能是由于Shewanella sp. JN01通过硫酸盐还原产生大量的硫化氢,使溶液中的Cu几乎都生成硫化铜沉淀被去除[30]图3). 不同络合态Cu处理后沉淀物中Cu和S的强峰表明,沉淀物中CuS是主要产物,这与XRD结果一致. 此外,无论溶液的pH值如何,CuS (Ksp=6.3×10−36)的溶解度低且稳定性高[31]. 实验结果表明,模拟淋洗废液中Cu络合物的去除机理主要是经Shewanella sp. JN01破络后生成硫化物沉淀.

    • SRB (Shewanella sp. JN01)对水溶液中的Cu络合物具有较高的去除效率,主要通过先破络后形成硫化物沉淀. Shewanella sp. JN01对不同Cu络合物的最佳去除率为Cu-CA (99.11%) > Cu2+ (97.69%) > Cu-EDTA (95.90%) > Cu-GLDA (94.22%) > Cu-MC (85.5%). 络合剂对Shewanella sp. JN01的抑制作用为EDTA > MC > GLDA > CA. 本研究的结果为从水溶液中去除Cu络合物提供了一种有效、节约成本和环境友好的方法. 然而,由于实际淋洗废液中所含物质比模拟淋洗废液更为复杂,因此有必要进一步探索SRB (Shewanella sp. JN01)对实际淋洗废液中多种重金属络合物的最佳去除效率.

    参考文献 (31)

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