-
有机肥的施用能够提高农田土壤的肥力，维持土壤养分平衡并优化土壤微生物群落组成，进而提高农作物的产量和品质[1 − 4]. 在环境治理领域，向污染土壤中施用有机肥可以促进各种污染物的降解. 齐建超等[5]采用有机肥和菌剂联合修复石油污染土壤，可使土壤中总石油烃、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的降解率达到73%、74.7%、55.5%. 常慧萍[6]发现，施入有机肥的土壤中石油烃降解率高达到76.7%. 伍港繁等[7]的研究表明，有机肥能够强化象草对土壤中镉的富集效果. Song 等[8]发现，有机肥能促进低溶解度、高稳定性的砷酸钙矿物的形成，从而对砷污染土壤起到修复作用.
石油是由烷烃和芳香烃组成的复杂混合物. 许多研究证实了有机肥施入可对土壤中的石油烃污染物起到有效去除作用[9 − 11]. 然而，对于有机肥施入土壤后石油烃不同组分的去除特性及作用机制的研究文献报道相对较少，不同研究者所得结果也并不一致. 如 Gupta[11]认为有机肥中蕴含的丰富微生物和油污土壤中的功能降解菌存在协同互促作用. 毛丽华等[12]则认为向油污土壤中施入有机肥可增加微生物与石油烃接触的吸附点位，从而对石油烃产生较高的降解效率，Wu 等[13]则认为有机肥的施入改变了土壤土著微生物菌群结构，为石油污染的生物降解提供了有利条件.
为探究有机肥施用对土壤中石油烃不同组分的去除特性和生物降解机制，本文从有机肥中提取微生物，通过比较向石油污染土壤中施入完整有机肥和接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理对石油烃的去除效果及土壤微生态变化，探究有机肥对污染土壤中石油烃的去除效果和作用机制，研究可为有机肥修复石油污染土壤的作用机制提供理论基础.
-
试供黄绵土采自陕西省延安市志丹县某油田附近，土壤基本理化性质见表1. 黄绵土样经风干、除杂、过筛（2 mm），混匀后进行后续的修复实验研究.
-
实验所用的腐熟有机肥取自西北农林科技大学，以干质量比1:2的猪粪、稻壳再加入5.0%的木炭渣经堆制腐解而成，经风干、过筛（40目）后保存待用. 有机肥的基本性质见表2.
-
准确称取
5.0000 g 有机肥置于150 mL 锥形瓶中，加入50 mL 灭菌的 PBS 缓冲液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.584 g，KH2PO4 0.27 g，定容至1L，pH 调节至7.0—7.4），恒温水浴振荡培养2 h，吸取1 mL 培养液加入到150 mL 灭菌的 L9培养基（Na2HPO4·12H2O 17.698 g，KH2PO4 3 g，NH4Cl 1 g，NaCl 0.5 g，1 mol·L−1 MgSO4 1 mL， MnCl2·2H2O 23 mg，MnCl4·H2O 30 mg，H3BO3 31 mg，CoCl2·6H2O 36 mg，CuCl2·2H2O 10 mg，NiCl2·6H2O 20 mg，Na2Mo4·2H2O 30 mg，ZnCl2 50 mg，定容至1 L）中，30℃、150 r·min−1恒温振荡培养24 h 后，将培养物置于50 mL 离心管中，3000 r·min−1离心5 min 后，弃除上清液获得从有机肥中提取的微生物，加入20 mL 灭菌的 L9培养基清洗后离心，重复上述操作3次后，将获得的菌体置于20 mL 灭菌的 L9培养基中， 获得有机肥中微生物的菌悬液. -
分别称取9份1.0 kg 石油污染土壤放入花盆中进行模拟生物修复实验. 修复试验方案如表3所示，设置 TF、TW、CK 三个处理组，每个处理3个平行. TF 为向石油污染土壤中添加有机肥，TW 为向石油污染土壤中接种从有机肥中提取的微生物（提取方法见“1.3.1”），CK 为自然条件下放置的污染土壤，定期向土壤中加入灭菌纯水以保持土壤含水率为15%，每2 d 翻动一次通氧，分别于修复的0、7、15、21、30、60 d 取样，对土壤中的石油烃含量、理化性质、微生物数量进行测定.
-
土壤含水率、pH、有效磷、铵态氮、硝态氮的测定方法见“土壤分析技术规范”[14]. 含水率采用烘干称重法测定，pH 采用电极法测定，有效磷采用钼酸铵分光光度法测定，铵态氮采用靛酚蓝比色法测定，硝态氮采用紫外分光光度法测定.
-
土壤中的 TPH 采用超声波提取-重量法[15]测定；利用柱层析法净化和分离 TPH 中的脂肪烃及芳香烃组分并采用重量法进行测定[16].
C10—C40正烷烃、3种多环芳烃的测定：将脂肪烃和芳香烃组分分别用正己烷和二氯甲烷（色谱级）溶剂溶解后，采用气相色谱-氢火焰离子检测器（GC-FID，Clarus PE680，美国安捷伦科技公司）进行测定.
正烷烃（C10—C40）测定参数：色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气（N2）：1.5 mL·min−1；分流进样；进样口温度300 ℃，检测器温度325 ℃；升温程序：50 ℃保持2 min，以30 ℃·min−1升至300℃，后以50 ℃·min−1升至325℃，保持8 min；空气流量450 mL·min−1，氢气流量45 mL·min−1.
PAHs 测定参数：色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气 N2，1.5 mL·min−1；不分流进样；进样口温度280℃，检测器温度320℃；升温程序：80℃保持4 min，以8 ℃·min−1升至170℃，再以相同速率升至250℃，保持10 min，后以10 ℃·min−1升至300℃，保持10 min；空气流量450 mL·min−1，氢气流量45 mL·min−1.
-
采用流式细胞术测定土壤中活性菌数量. 向1.00 g 土壤加入9 mL 灭活的 PBS 缓冲液，(20±2) ℃、150 r·min−1恒温振荡培养0.5 h 后，将培养物过5 μm 的滤膜，形成菌悬液. 向1 mL 菌悬液中加入2.5 mg·L−1NaClO[17]，避光处理10 min 后得到灭活细菌，以 NaClO 灭活的细菌作为阴性对照，未使用 NaClO 灭活的细菌作为阳性对照，将灭活后的细菌和未灭活的细菌分别利用 SG/PI 双染色剂进行染色后，根据文献[18]确定流式细胞仪的基本参数，利用流式细胞仪（Accuri C6，美国 BD 公司）进行测定. 根据阳性和阴性对照出现的位置区域不同确定活菌的位置，确定活菌的数量[19].
-
将修复至60 d 的土壤样品送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序分析. 主要的分析步骤如下：将土壤样品进行预处理后，利用 OMEGA 试剂盒（Life. USA）提取土壤中总 DNA，再利用琼脂糖凝胶电泳技术检测 DNA 的完整性；利用 Qubit 定量测定 DNA 浓度；利用341F/805R 引物（341F 引物：5’－CCCTACACGACGCTCT－TCCGATCTG－3’；805R 引物：5’－GACTGGAGTTC－CTTGGCACCCGAATTCCA－3’）进行 PCR 扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小、再利用 Qubit 荧光定量仪测定浓度后，采用 Illumina 平台对群落 DNA 片段进行双端测序.
-
利用 Microsoft Excel 2019进行数据处理；采用 SPSS 26.0软件进行单因素（one-way ANOVA）方差分析和不同处理间的差异性显著性检验；利用 FlowJo V10对微生物数量进行统计分析. 采用 origin 2021进行图表绘制.
-
不同修复处理土壤中总石油烃、脂肪烃、芳香烃的含量变化如图1（a-c）所示，修复60 d，向石油污染土壤中施入有机肥（TF）、接种从有机肥中提取的微生物（TW）、自然降解（CK）3个处理中总石油烃（total petroleum hydrocarbon，TPH）含量分别由
21140 、22140 、22140 mg·kg−1降低至14367 、20553 、21220 mg·kg−1，TPH 去除率分别为32.13%、4.16%、7.17%；脂肪烃组分含量由15040 、15720 、15720 mg·kg−1分别降低至8920 、14320 、13960 mg·kg−1，去除率分别为34.44%、9.16%、11.20%；芳香烃组分含量由3540 、3860 、3840 mg·kg−1分别降低至2980 、3560 、3460 mg·kg−1，去除率分别为15.82%、7.77%、9.99%. 与 CK 相比，向污染土壤中施入完整有机肥对 TPH 和组分烃的去除起到明显促进作用，接种从有机肥中提取的微生物对 TPH 和组分烃的去除起到弱抑制作用.对不同修复处理土壤中的石油烃、脂肪烃和芳香烃含量变化进行了动力学模拟（图1d-f）. 结果表明土壤中石油烃的降解符合一级动力学反应. TF、CK 和 TW 处理的 TPH 生物降解动力学常数分别为
0.0068 、0.0011 和0.0006 （图1d），降解半衰期分别为102 d、630 d和1155 d；脂肪烃组分的降解动力学常数分别为0.0086 、0.0017 和0.0014 ，降解半衰期分别为81 d、408 d 和495 d（图1e）；芳香烃组分的降解动力学常数分别为0.0029 、0.0018 和0.0013 ，降解半衰期分别为239 d、385 d 和533 d（图1f）.图2a-c为3种修复方式对 TPH 中 C10—C40 正烷烃的去除效果. 修复60 d, CK 土壤中的中链烷烃 F2（C10—C26）、中长链烷烃 F3（C27—C34）和长链烷烃 F4（C35—C40）的去除量分别为4.91、106.00、28.02 mg；TF 土壤中F2、F3、F4烷烃的去除量分别为5.83、407.89、32.75 mg；TW 土壤中的 F2、F3、F4的去除量分别为5.07、105.02、22.37 mg. 与 CK 相比，向污染土壤中施入有机肥进行修复处理显著提高了对中长链烷烃组分 F2（C27—C34）的去除效率，接种从有机肥中提取的微生物对长链烷烃组分 F3（C35—C40）的去除效果起到抑制作用.
图2d-f 为3种修复方式对石油污染土壤中的芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝等3种多环芳烃的去除效果. 修复60 d，CK处理中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.27、0.50、1.84 mg；TF 中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.30、0.90、2.47 mg；TW 土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的去除量分别为0.22、0.46、1.74 mg. 不同修复处理对油污黄绵土中的多环芳烃去除效果均相对较差.
石油是由脂肪烃和芳香烃为主要成分的复杂混合物. 由于芳香烃含有稳定的苯环结构而难于被微生物降解. 本文中向污染土壤中加入有机肥对脂肪烃组分的降解率最高，所得结果与文献报道一致[20 − 22]. 在利用 GC-FID 研究三种修复方式对石油污染土壤中多环芳烃的去除效果时，发现施入有机肥以及接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理，对芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝等3种多环芳烃的去除最为有效，因此，本文选取3种多环芳烃进行分析. 根据文献报道，石油污染土壤中的正烷烃（C6—C40）根据碳数不同可分为短链烃 F1（C6—C9，易挥发）、中链烃 F2（C10—C26，半挥发性）、中长链烃 F3（C27—C34，难挥发性）和长链烷烃 F4（C35—C40）组分. 短链烷烃 F1的易挥发性使其在石油污染土壤中含量较少，中长链组分烃 F3在油污土壤中的含量最多[23 − 24]. 本文中向石油污染土壤中施入有机肥修复60 d，与 CK 相比对中长链烷烃组分 F3去除效率提高了3倍，说明有机肥的施入可显著提高土壤微生物对中长链正烷烃的降解. 向油污土壤中接种从有机肥中提取的微生物总石油烃中的多种组分烃的去除起到弱抑制作用，可能是由于有机肥中的微生物与土壤中的土著石油烃降解菌形成了竞争或者拮抗关系所致.
-
图3为修复过程中的土壤理化性质变化情况. 修复60 d，CK 处理中土壤铵氮、硝氮、有效磷含量分别由2.54、7.31、8.56 mg·kg−1降低至1.07、3.67、3.39 mg·kg−1；添加有机肥处理的土壤（TF）中铵氮、硝氮、有效磷含量分别由98.60、28.16、60.16 mg·kg−1降低至82.47、22.07、33.23 mg·kg−1；接种从有机肥中提取的微生物（TW），土壤铵氮、硝氮、有效磷含量分别由2.48、7.23、7.64 mg·kg−1降低至1.12、3.23、6.55 mg·kg−1.
一些文献研究认为，pH 过高会抑制土壤微生物的活性，进而影响土壤养分的吸收和利用[25 − 26]. 施入有机肥修复使得土壤 pH 显著降低，这就为石油烃类降解菌提供了有利的生存环境，进而促进了对污染物的降解[27 − 28]. 3种不同修复处理土壤中的有效磷、铵态氮和硝态氮浓度呈明显降低的变化趋势，说明微生物在降解石油烃过程中需利用有效磷、铵态氮和硝态氮以进行生长代谢.
-
利用流式细胞术测定土壤中高活性细胞数量[29]. 经 NaClO 灭活处理后的 CK、TW、TF 土壤中细胞赋存情况分别如图4中的 a、b、c 所示，左上方细胞所占比例达到99.4%、99.5%、99.1%，因此划定左上方为死细胞区域，则右下方为高活性细胞区域. 图4中的 d、e、f 分别是未经 NaClO 灭活的 CK、TW、TF 土壤中高活性细胞（右下方区域）和死细胞（左上方区域）赋存情况：右下方的高活性细菌占比为8.7%、4.5%、69.1%. 说明经过60 d 的修复处理，施入有机肥（TF）进行修复处理的土壤中的高活性菌比例明显高于自然降解和接种从有机肥中提取的微生物修复的处理.
图5a 为利用流式细胞术测得的土壤总微生物数量，在 CK 处理中，总微生物数量在5.07×108—6.58×108 CFU·g−1土之间，总体上趋于稳定；施入有机肥进行修复（TF）使得土壤总微生物数量显著增加. 修复7 d，土壤中的总微生物数量由1.12×109 CFU·g−1土增加至3.73×109 CFU·g−1土，7 d 后呈降低趋势，修复60 d 时土壤中微生物总量为3.07×109 CFU·g−1土；接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理的土壤（TW）中的总微生物在初始时最多（6.60×108 CFU·g−1土），15 d 后减少至4.02×108 CFU·g−1土， 21 d 时减少至1.98×108 CFU·g−1土，21 d 后逐渐趋于平缓.
图5b 为利用流式细胞术测得的各土壤中高活性菌数量，与总菌数变化相似，在 CK 处理中，微生物活性菌数量在0—15 d 内呈增加趋势，在第15 d 时数量达到最大（2.48×108 CFU·g−1土），随后高活性菌数量降低，在第21 d 降低至1.46×107 CFU·g−1土后逐渐趋于平缓. 施入有机肥进行修复（TF）7 d 后，土壤中的高活性菌数量由最初的8.94×108 CFU·g−1土增加至3.45×109 CFU·g−1土，随后逐渐降低，修复60 d 时土壤中高活性菌数量为1.92×109 CFU·g−1土. 接种从有机肥中提取的微生物进行修复处理的土壤（TW）中的高活性菌在修复开始时最多（2.93×108 CFU·g−1土），修复15 d 后减少至1.51×108 CFU·g−1土， 21 d 时减少至8.39×106 CFU·g−1土，21 d 后逐渐趋于平缓.
图5中自然放置的污染土壤中（CK）微生物的增长曲线和培养皿中微生物生长曲线相似[30]. 向污染土壤中接种从有机肥提取的微生物（TW），在接种的第1天 高活性微生物数量增加明显（图1-b 中与 CK 相比），随后由于土壤土著微生物和有机肥中的微生物发生拮抗或竞争而使土壤中高活性菌数量降低[31 − 32]. 在施入完整有机肥的土壤中（TF），有机肥中丰富的养分使得高活性菌的数量增加显著. 有机肥添加后的第7 天 微生物群落及活性菌总数增加明显，但是随后出现降低趋势. 主要是由于有机肥施入的初期，其蕴含的丰富氮磷养分促进了土壤中微生物的增殖，进而促进了石油烃的降解. 有机肥添加7 d 后，可能由于石油烃降解产生的中间产物的毒性以及细胞的增殖凋亡规律，使得总微生物和高活性微生物数量明显降低[33 − 34].
-
由表4可知，经过60 d 的自然修复，自然放置的土壤中 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别为788、6.06、0.932；施入有机肥修复处理的土壤（TF）的 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数最大，分别为
1174 、7.72、0.981；接种从有机肥中提取的微生物（TW），土壤 Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别为856、6.35、0.945. 与 CK 相比，向污染土壤中施入完整有机肥显著提高了土壤微生物多样性指数，接种从有机肥中提取的微生物使得土壤多样性指数略有增加.在施入有机肥进行修复的土壤中，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数明显高于同时期的其他处理土壤. 可能是由于有机肥的施入既可以增加土壤的通气性，其丰富的养分又能促进土壤中微生物的增殖[35 − 36]. 接种从有机肥中提取微生物的修复1 d 后（TW_1d），微生物的多样性指数低于自然放置的土壤，结合图5中对高活性菌的测定结果表明向石油污染土壤中施入从有机肥中提取的微生物后，土壤中的高活性菌数量在7—15 d 时减少（与 CK 相比较），结果说明有机肥中的微生物和土著微生物存在弱拮抗作用.
-
土壤中微生物的不同分类水平相对丰度如图6所示. 根据图6a，在所有土壤样本中放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）均为最优势菌门. 自然放置的污染土壤中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度分别为48.51%、31.87%和8.78%；修复60 d，CK 处理和 TW 处理土壤中的巴氏杆菌门（Patescibacteria）相对丰度分别从2.05%和1.34%上升至15.2%和6.23%. TF 处理土壤中的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度从6.53%上升至11.38%.
根据图6b-6e，在 CK 土壤中，隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）的分枝杆菌属（Mycobacterium）是土壤中的最优势菌属（11.60%）. 修复60 d 后，CK 土壤中隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—诺卡氏菌科（Nocardiaceae）的诺卡氏菌属（Nocardioide）、隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—链孢囊菌亚目（Streptosporangineae）—链孢囊菌科（Streptosporangineae）的嗜热单胞菌属（Thermomonas）、隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—假诺卡氏亚目（Pseudonocardineae）—假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）科的糖单胞菌科属（Saccharimonadaceae）相对丰度分别增加至27.79%、6.19%和13.74%. 而在TW 处理中这3种菌属的丰度分别为26.29%、6.88%、4.93%. TF 处理土壤中优势菌属包括隶属于放线菌门（Actinobacteria）—放线菌纲（Actinobacteria）—棒杆菌亚目（Corynebacterineae）—迪茨氏菌科（Dietziaceae）的迪茨氏菌属（Dietzia）、隶属于诺卡氏菌科（Nocardiaceae）的红球菌属（Rhodococcus）和隶属于变形菌门（Gammaproteobacteria）—γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）—黄单胞菌目（Xanthomonadales）—溶杆菌科（Lysobacteraceae）的溶杆菌属（Lysobacter），其相对丰度分别为 13.34%、6.13%、7.57%.
放线菌门和变形菌门是文献报道的可降解石油烃的优势菌门[37 − 38]. 迪茨氏菌属（Dietzia）[39 − 40]、红球菌属（Rhodococcus）[41]、溶杆菌属（Lysobacter）[42]、诺卡氏菌属（Nocardioide）[43]是文献报道的常见石油烃降解菌. 本文中向污染土壤中施入有机肥（TF处理）修复60 d，这些石油烃降解菌属在其门、纲、目、科分类学中的丰度明显增加. 说明有机肥的施入促进了土壤中石油烃降解菌的生长.
-
向石油污染土壤中施入有机肥对脂肪烃组分的去除有明显促进作用，尤其对 C27—C34正烷烃组分的去除效率比自然降解提高了3倍. 有机肥对于芳香烃组分的去除效果较差. 有机肥中的微生物与石油污染土壤中的土著微生物存在弱拮抗作用，有机肥中蕴含的丰富氮磷养分促进了土壤中高活性菌的增殖和土著石油烃降解菌的生长，维持了土壤菌群结构多样性的稳定，并降低了土壤 pH 值. 有机肥施用情况下土壤中石油烃降解菌的生长、高活性菌数量的增加以及菌群结构的稳定使得土壤中石油烃的去除效果明显增加.
施用有机肥对黄绵土中石油烃污染物的去除特性及作用机制
Removal characteristics and degradation mechanism of petroleum hydrocarbons in the loess soil by applying organic fertilizers
-
摘要: 向石油污染土壤中施入有机肥可以增加土壤的保水、保温、透气能力，促进土壤微生物的生长和活性，达到石油烃去除的目的. 目前对于有机肥施入后不同组分烃的去除特性以及有机肥生物降解石油烃的作用机制尚不清楚. 本文设置了向石油污染土壤中施入有机肥（TF）和接种从有机肥中提取的微生物（TW）两个处理. 利用重量法和 GC-FID 分别对土壤中的总石油烃（total petroleum hydrocarbon，TPH）和不同组分烃进行测定，采用分子生物学技术分析了土壤微生物变化. 结果表明，修复60 d，TF 处理对土壤中的 TPH、脂肪烃组分、芳香烃组分的去除率分别为32.13%、34.44%、15.82%，土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的消减量分别为0.30、0.90、2.47 mg·kg−1土；TW 处理对 TPH、脂肪烃和芳香烃的去除率分别为4.16%、9.16%和7.77%，土壤中芘、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]苝的消减量分别为0.27、0.50、1.84 mg·kg−1土. 流式细胞术和高通量测序测定结果表明，TF 土壤中高活性菌数量由3.16×107增加至1.92×109 CFU·kg−1土，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别由788、6.06、0.932增加至
1174 、7.72、0.981. TW 土壤中的高活性菌数量降低至9.87×106 CFU·kg−1土，Chao 1指数、Shannon 指数、Simpson 指数分别降低至855.8、6.35、0.945. 研究表明向石油污染土壤中施入完整有机肥对总石油烃和脂肪烃组分的去除具有明显促进作用，但对土壤中芳香烃组分的去除效果较差. 接种从有机肥中提取的微生物对总石油烃和组分烃的降解有微弱抑制作用. 结果说明有机肥中的微生物与污染土壤中的土著微生物存在弱拮抗作用，有机肥中富含的丰富养分显著提高了土壤土著微生物多样性和高活性菌数量，进而对总石油烃和脂肪烃组分起到有效降解作用.Abstract: The application of organic fertilizer to remediation of the oil-contaminated soils can effectively degrade petroleum hydrocarbons due to increase the soil's moisture, thermal insulation, and air permeability, thereby promoting the growth of soil microorganisms. However, the removal characteristics and biodegradation mechanism of petroleum hydrocarbons using organic fertilizer are still unclear. In this study, two treatments including applying organic fertilizer (TF) and inoculating of microorganisms which obtained from organic fertilizer (TW) were set up in order to illustrate the issues. The total petroleum hydrocarbon (TPH) and hydrocarbon fractions were determined using the gravimetric method and GC-FID, respectively; soil microorganisms were analyzed using molecular biology techniques. Results showed that after 60 days of remediation, the removal rates of the TPH, aliphatic, and aromatic fractions were 32.13%, 34.44%, and 15.82%, respectively; and the reduction amounts of pyrene, benzo [a] pyrene, and benzo [g,h,i] perylene respectively were 0.30, 0.90, and 2.47 mg·kg−1 in the TF treatment. In the TW treatment, the removal rates of the TPH, aliphatic, and aromatic fractions were 4.16%, 9.16%, and 7.77%, respectively; as well as the reduction amounts of pyrene, benzo [a] pyrene, and benzo [g,h,i] perylene respectively were 0.27, 0.50, 1.84 mg·kg−1. The flow cytometry and high-throughput sequencing showed that the number of highly active bacteria increased from 3.16×107 to 1.92×109 CFU·kg−1 soil, and the Chao1, Shannon, and Simpson index increased respectively from 788, 6.06, and 0.932 to1174 , 7.72, and 0.981 in the TF soil. In the TW soil, the quantities of highly active bacteria decreased to 9.87×106 CFU·kg−1soil; and the Chao 1, Shannon, and Simpson index decreased to 855.8, 6.35, and 0.945, respectively. Results indicated that application of organic fertilizer to the oil-contaminated soil could promote biodegradation of TPH and aliphatic hydrocarbon, but the removal effect of the aromatic components is poor. Inoculation of the microorganisms which extracted from the organic fertilizer present weak inhibitory effects on the degradation of the TPH and hydrocarbon components. This study suggested that the weak antagonistic effects presented on microorganisms which obtained from the organic fertilizers and the indigenous bacteria of oil-polluted soil. The affluent nutrients of the organic fertilizers significantly improved the diversities of the microorganisms and the quantities of highly active bacteria in the soil, thereby effectively promoting degradation the TPH and alkane components. -
-
图 1 不同修复处理对土壤中TPH、脂肪烃组分、芳香烃组分的去除效果
Figure 1. The concentrations and removal efficiencies of the TPH and hydrocarbon fractions in different treatments
图 2 土壤中不同组分烃含量变化
Figure 2. The concentrations of different fractional petroleum hydrocarbons in cultivated loessial soil
图 3 不同修复处理土壤的理化性质变化
Figure 3. The changes of physical and chemical properties in different treatments
图 5 不同修复处理的土壤中高活性微生物数量变化
Figure 5. The number of soil microorganisms in different treatments
图 6 不同处理土壤中细菌的群落组成和相对丰度
Figure 6. Composition and relative abundance of bacterial community in different treatments
表 1 石油污染土壤的理化性质
Table 1. Physical properties of the petroleum-contaminated soil
指标
IndexpH 有效磷/
（mg·kg−1）
Phosphate铵态氮/
（mg·kg−1）
Ammonia nitrogen硝态氮/
（mg·kg−1）
Nitrate nitrogen含水率/%
Moisturecontent细菌总数/
（CFU·g−1土）
Total bacteriacount总石油烃/（mg·kg−1）
Total petroleum
hydrocarbon含量
Content8.54 8.56 2.53 3.71 1.22 5.87×108 22140 
下载: 导出CSV
表 2 有机肥的基本性质（mg·kg−1）
Table 2. Basic properties of organic fertilizer （mg·kg−1）
指标
IndexC N P K Na Ca S 含量
Content185600 20400 6500 36200 3810 21300 1575
下载: 导出CSV
表 3 生物修复实验方案
Table 3. Experimental project for remediation of oil-polluted soil
样品
Sample修复方案
Experimental planTF 1.0 kg 试供土壤+150 g 有机肥 TW 1.0 kg 试供土壤+有机肥中提取的微生物（108 CFU·g−1土） CK 1.0 kg 试供土壤（自然降解）
下载: 导出CSV
表 4 不同处理土壤中细菌的α多样性
Table 4. The α-diversity of soil bacterial community in different treatments
CK_1d CK_60d TW_1d TW_60d TF_1d TF_60d OTU 1309 787 1151 845 1455 1173 Chao1 1312 788 1154 856 1455 1174 Shannon 7.77 6.06 7.37 6.35 8.49 7.72 Simpson 0.986 0.932 0.982 0.945 0.991 0.981 Coverage 0.999 0.999 0.999 0.999 0.999 0.999
下载: 导出CSV
-
[1] BUYANOVSKY G A, ASLAM M, WAGNER G H. Carbon turnover in soil physical fractions[J]. Soil Science Society of America Journal, 1994, 58(4): 1167-1173. doi: 10.2136/sssaj1994.03615995005800040023x [2] 王长军, 王肇陟, 王世荣. 生物有机肥、腐殖酸对水稻产量和土壤化学性质的影响[J]. 江苏农业科学, 2016, 44(1): 93-95. WANG C J, WANG Z Z, WANG S R. Effects of bio-organic fertilizer and humic acid on rice yield and soil chemical properties[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2016, 44(1): 93-95 (in Chinese).
[3] 聂俊, 邱俊荣, 史亮亮, 等. 有机肥和化肥配施对抛栽水稻产量、品质及钾吸收转运的影响[J]. 江苏农业科学, 2016, 44(2): 122-125. NIE J, QIU J R, SHI L L, et al. Effects of combined application of organic fertilizer and chemical fertilizer on yield, quality, potassium absorption and transport of cast-planted rice[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2016, 44(2): 122-125 (in Chinese).
[4] 张晨阳, 徐明岗, 王斐, 等. 施用有机肥对我国大豆产量及土壤养分的影响[J]. 中国农业科技导报, 2023, 25(8): 148-156. ZHANG C Y, XU M G, WANG F, et al. Effects of manure application on soybean yield and soil nutrients in China[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2023, 25(8): 148-156 (in Chinese).
[5] 齐建超, 张承东, 乔俊, 等. 微生物与有机肥混合剂修复石油污染土壤的研究[J]. 农业环境科学学报, 2010, 29(1): 66-72. QI J C, ZHANG C D, QIAO J, et al. Bioremediation of petroleum-contaminated soil by mixed microbes and organic fertilizer[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2010, 29(1): 66-72 (in Chinese).
[6] 常慧萍. 石油烃污染土壤的生物修复[J]. 生物学杂志, 2008, 25(1): 55-56. doi: 10.3969/j.issn.2095-1736.2008.01.016 CHANG H P. Bioremediation of oil-contaminated soil[J]. Journal of Biology, 2008, 25(1): 55-56 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.2095-1736.2008.01.016
[7] 伍港繁, 周航, 唐棋, 等. 肥料调控强化象草对重度Cd污染农田修复效果[J]. 环境科学, 2022, 43(12): 5761-5768. WU G F, ZHOU H, TANG Q, et al. Effects of strengthening Pennisetum purpureum schumach with fertilizer application strategy on remediation of severely cadmium-polluted farmland[J]. Environmental Science, 2022, 43(12): 5761-5768 (in Chinese).
[8] LONG S, NING X, WANG S L, et al. Remediation of arsenic-contaminated calcareous agricultural soils by iron-oxidizing bacteria combined with organic fertilizer[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2023, 30(26): 68258-68270. doi: 10.1007/s11356-023-27217-5 [9] SARI G L, TRIHADININGRUM Y, WULANDARI D A, et al. Compost humic acid-like isolates from composting process as bio-based surfactant: Properties and feasibility to solubilize hydrocarbon from crude oil contaminated soil[J]. Journal of Environmental Management, 2018, 225: 356-363. [10] CHEN M, XU P, ZENG G M, et al. Bioremediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons, petroleum, pesticides, chlorophenols and heavy metals by composting: Applications, microbes and future research needs[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6): 745-755. doi: 10.1016/j.biotechadv.2015.05.003 [11] GUPTA G, TAO J M. Bioremediation of gasoline-contaminated soil using poultry litter[J]. Journal of Environmental Science and Health Part A:Environmental Science and Engineering and Toxicology, 1996, 31(9): 2395-2407. doi: 10.1080/10934529609376498 [12] 毛丽华, 刘菲, 马振民, 等. 生物通风堆肥法修复原油污染土壤的实验研究[J]. 环境科学学报, 2009, 29(6): 1263-1272. doi: 10.3321/j.issn:0253-2468.2009.06.022 MAO L H, LIU F, MA Z M, et al. Remediation of crude oil-contaminated soil by bioventing and composting technology[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2009, 29(6): 1263-1272 (in Chinese). doi: 10.3321/j.issn:0253-2468.2009.06.022
[13] WU M L, GUO X Q, WU J L, et al. Effect of compost amendment and bioaugmentation on PAH degradation and microbial community shifting in petroleum-contaminated soil[J]. Chemosphere, 2020, 256: 126998. doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.126998 [14] 全国农业技术推广服务中心. 土壤分析技术规范[M]. 第2版. 北京: 中国农业出版社, 2006. National Agricultural Technology Extension Service Center. Technical specifications for soil analysis[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2006(in Chinese).
[15] 姜岩, 伍涛, 张贤明. 土壤中石油烃预处理及含量分析方法研究进展[J]. 土壤, 2015, 47(3): 461-465. JIANG Y, WU T, ZHANG X M. Research progresses of pretreatment and determination methods for petroleum hydrocarbons in soils[J]. Soils, 2015, 47(3): 461-465 (in Chinese).
[16] 胡迪, 李川, 董倩倩, 等. 油田区土壤石油烃组分残留特性研究[J]. 环境科学, 2014, 35(1): 227-232. HU D, LI C, DONG Q Q, et al. Compositions and residual properties of petroleum hydrocarbon in contaminated soil of the oilfields[J]. Environmental Science, 2014, 35(1): 227-232 (in Chinese).
[17] 赵琳, 王晓昌. 紫外与次氯酸钠消毒效果及影响因素研究[J]. 环境污染与防治, 2014, 36(7): 41-45. doi: 10.3969/j.issn.1001-3865.2014.07.010 ZHAO L, WANG X C. Study on performance and influencing factors of UV disinfection and sodium hypochlorite disinfection[J]. Environmental Pollution & Control, 2014, 36(7): 41-45 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1001-3865.2014.07.010
[18] WAN Q Q, WEN G, CAO R H, et al. Simultaneously enhance the inactivation and inhibit the photoreactivation of fungal spores by the combination of UV-LEDs and chlorine: Kinetics and mechanisms[J]. Water Research, 2020, 184: 116143. doi: 10.1016/j.watres.2020.116143 [19] 李可欣, 吴蔓莉, 高欢, 等. 基于流式细胞术的活性多环芳烃降解菌检测技术[J]. 分析化学, 2021, 49(8): 1357-1365. LI K X, WU M L, GAO H, et al. Determination of active polycyclic aromatic hydrocarbons degrading bacteria using flow cytometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2021, 49(8): 1357-1365 (in Chinese).
[20] 刘五星, 骆永明. 土壤石油污染与生物修复[M]. 北京: 科学出版社, 2015. LIU W X, LUO Y M. Soil petroleum pollution and bioremediation[M]. Beijing: Science Press, 2015(in Chinese).
[21] LEYS N M, BASTIAENS L, VERSTRAETE W, et al. Influence of the carbon/nitrogen/phosphorus ratio on polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by Mycobacterium and Sphingomonas in soil[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 66(6): 726-736. doi: 10.1007/s00253-004-1766-4 [22] KIM J, LEE A H, CHANG W. Manipulation of unfrozen water retention for enhancing petroleum hydrocarbon biodegradation in seasonally freezing and frozen soil[J]. Environmental Science & Technology, 2021, 55(13): 9172-9180. [23] MALETIĆ S P, DALMACIJA B D, RONČEVIĆ S D, et al. Impact of hydrocarbon type, concentration and weathering on its biodegradability in soil[J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 2011, 46(10): 1042-1049. doi: 10.1080/10934529.2011.590380 [24] MANCERA-LÓPEZ M E, ESPARZA-GARCÍA F, CHÁVEZ-GÓMEZ B, et al. Bioremediation of an aged hydrocarbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2008, 61(2): 151-160. [25] 杨欢, 尹春英, 唐波, 等. 川西亚高山针叶林树种云杉和冷杉土壤酸碱性差异及其机制[J]. 生态学报, 2018, 38(14): 5017-5026. YANG H, YIN C Y, TANG B, et al. Difference in soil pH values between Picea asperata and Abies faxoniana stands in subalpine regions and a preliminary study on its mechanism[J]. Acta Ecologica Sinica, 2018, 38(14): 5017-5026 (in Chinese).
[26] GUO J H, LIU X J, ZHANG Y, et al. Significant acidification in major Chinese croplands[J]. Science, 2010, 327(5968): 1008-1010. doi: 10.1126/science.1182570 [27] 许殷瑞, 吴蔓莉, 王丽, 等. 陕北石油污染土壤微生物种群变化及影响因素[J]. 中国环境科学, 2021, 41(9): 4349-4359. doi: 10.3969/j.issn.1000-6923.2021.09.042 XU Y R, WU M L, WANG L, et al. The influences of petroleum pollution on the microbial population distribution in Northern Shaanxi Province of China[J]. China Environmental Science, 2021, 41(9): 4349-4359 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-6923.2021.09.042
[28] 王利利, 董民, 张璐, 等. 不同碳氮比有机肥对有机农业土壤微生物生物量的影响[J]. 中国生态农业学报, 2013, 21(9): 1073-1077. doi: 10.3724/SP.J.1011.2013.01073 WANG L L, DONG M, ZHANG L, et al. Effects of organic manures with different carbon-to-nitrogen ratios on soil microbial biomass of organic agriculture[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2013, 21(9): 1073-1077 (in Chinese). doi: 10.3724/SP.J.1011.2013.01073
[29] 文刚, 王静怡, 黄廷林, 等. 流式细胞仪在水处理中的应用现状与展望[J]. 中国给水排水, 2014, 30(18): 58-62. WEN G, WANG J Y, HUANG T L, et al. Application of flow cytometer to water treatment: Status and perspectives[J]. China Water & Wastewater, 2014, 30(18): 58-62 (in Chinese).
[30] 朱艳蕾. 细菌生长曲线测定实验方法的研究[J]. 微生物学杂志, 2016, 36(5): 108-112. ZHU Y L. Experimental method of bacteria growth curve determination[J]. Journal of Microbiology, 2016, 36(5): 108-112 (in Chinese).
[31] GRACE LIU P W, CHANG T C, WHANG L M, et al. Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil: Effects of strategies and microbial community shift[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2011, 65(8): 1119-1127. [32] LIU P W G, WHANG L M, YANG M C, et al. Biodegradation of diesel-contaminated soil: A soil column study[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2008, 39(5): 419-428. doi: 10.1016/j.jcice.2008.03.006 [33] 宁川川, 王建武, 蔡昆争. 有机肥对土壤肥力和土壤环境质量的影响研究进展[J]. 生态环境学报, 2016, 25(1): 175-181. NING C C, WANG J W, CAI K Z. The effects of organic fertilizers on soil fertility and soil environmental quality: A review[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2016, 25(1): 175-181 (in Chinese).
[34] 杨彦明, 周祎, 张兴隆, 等. 秸秆有机肥交替施用对黑土理化特性及菌群结构的影响[J]. 中国土壤与肥料, 2021(4): 1-10. doi: 10.11838/sfsc.1673-6257.20267 YANG Y M, ZHOU Y, ZHANG X L, et al. The effects of alternation of straw and organic fertilizer on the physical and chemical properties of black soil and the structure of bacterial and fungal community[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2021(4): 1-10 (in Chinese). doi: 10.11838/sfsc.1673-6257.20267
[35] 徐慧芳, 万子维, 盛荣, 等. 不同耕作模式对稻田土壤真菌丰度及群落结构的影响[J]. 华中农业大学学报, 2022, 41(6): 35-41. doi: 10.3969/j.issn.1000-2421.2022.6.hznydx202206004 XU H F, WAN Z W, SHENG R, et al. Effects of farming patterns on abundance and community structure of fungi in paddy soils[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2022, 41(6): 35-41 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-2421.2022.6.hznydx202206004
[36] DEACON L J, JANIE PRYCE-MILLER E, FRANKLAND J C, et al. Diversity and function of decomposer fungi from a grassland soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006, 38(1): 7-20. doi: 10.1016/j.soilbio.2005.04.013 [37] JIAO S, LIU Z S, LIN Y B, et al. Bacterial communities in oil contaminated soils: Biogeography and co-occurrence patterns[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 98: 64-73. [38] 姚贞先, 王丽萍, 李丹, 等. 高效石油降解菌修复石油污染土壤与强化机制分析[J]. 环境科学, 2023, 44(8): 4599-4610. YAO Z X, WANG L P, LI D, et al. Remediation of petroleum-contaminated soil by highly efficient oil-degrading bacteria and analysis of its enhancement mechanism[J]. Environmental Science, 2023, 44(8): 4599-4610 (in Chinese).
[39] HU B, WANG M X, GENG S, et al. Metabolic exchange with non-alkane-consuming Pseudomonas stutzeri SLG510A3-8 improves n-alkane biodegradation by the alkane degrader Dietzia sp. strain DQ12-45-1b[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2020, 86(8): e02931-e02919. [40] 柳晓东, 余天飞, 艾加敏, 等. 石油污染对土壤微生物群落影响及石油降解菌的筛选鉴定[J]. 环境工程, 2022, 40(7): 61-68. LIU X D, YU T F, AI J M, et al. Influence of petroleum contamination on soil microbial community and isolation and identification of oil-degrading bacteria[J]. Environmental Engineering, 2022, 40(7): 61-68 (in Chinese).
[41] GIBU N, KASAI D, IKAWA T, et al. Characterization and transcriptional regulation of n-alkane hydroxylase gene cluster of Rhodococcus jostii RHA1[J]. Microorganisms, 2019, 7(11): 479. doi: 10.3390/microorganisms7110479 [42] 高飞. 基于生物刺激和生物强化策略的石油污染物降解效果研究[D]. 延安: 延安大学, 2019. GAO F. Study on degradation effect of petroleum pollutants by bioremediation based on Biostimulation and Bioaugmentation strategies[D]. Yan'an: Yan'an University, 2019 (in Chinese).
[43] 陈丽华, 孙万虹, 李海玲, 等. 石油降解菌对石油烃中不同组分的降解及演化特征研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(1): 124-133. CHEN L H, SUN W H, LI H L, et al. Biological degradation and transformation characteristics of different components in petroleum hydrocarbon by oil-degradation bacteria[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2016, 36(1): 124-133 (in Chinese).
-
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 416
- HTML全文浏览数: 416
- PDF下载数: 10
- 施引文献: 0
