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水苏糖（stachyose）是天然存在的四糖，结构由一分子棉子糖中的半乳糖基以α-1,6糖苷键与另一分子半乳糖相连接构成，是唇形科水苏属植物中天然存在的能显著促进人体肠道有益菌群增殖的功能性低聚糖，被誉为“天然超强双歧因子”[1-2]，被美国FAD 认定为GRAS（一般安全无毒食品） 的低聚糖产品. 目前文献主要针对水苏糖含量测定进行方法研究，主要有比色法[3]、离子色谱联用脉冲安培检测器法[4]、 高效液相色谱法[5-7]等，但鲜有关注水苏糖提取物中其他寡糖成分的定性和定量研究报道.
电喷雾检测器（charged aerosol detector，CAD）是近年来在药物分析领域运用较多的通用型检测器，已被成功应用于寡糖类化学物的分析检测[8]. 本文采用高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-LTQ/Orbitrap-MS）鉴定了水苏糖中多种寡糖成分，建立了HPLC-CAD方法，对水苏糖提取物中蔗糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊花糖以及两种未知组分开展了定量方法研究，对加强水苏糖提取过程中的质量控制、保证水苏糖相关产品安全性及有效性提供研究手段和方法依据.
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Ultimate 3000高效液相色谱仪，Corona Ultra RS电喷雾检测器，LTQ Orbitrap XL高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher公司）； XP205电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），IQ7000超纯水机（美国Millipore公司），超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；色谱柱：XBridge BEH Amide（4.6mm×250mm，5μm，美国Waters公司）.
乙腈（色谱纯，瑞典OCEANPAK公司），蔗糖对照品（纯度100%，中国食品药品检定研究院）、水苏糖（纯度90.5%，中国食品药品检定研究院）、棉子糖（纯度98%，百灵威公司）及甘露三糖（纯度98%，北京中科华检生物公司）；实验用水均为Milli-Q超纯水. 水苏糖样品3批（批号：201810131、201810132、201810133），均由中国医学科学院药物研究所提供.
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色谱条件：流动相乙腈-水（70:30，V/V），流速1.0 mL·min−1；柱温35℃；进样量10 μL；电喷雾检测器氮气压力为0.24 MPa，采集频率10 Hz，蒸发器温度35℃，滤波1 s.
质谱条件：电喷雾离子（ESI）源，正离子模式，高分辨数据采集，毛细管温度350℃，离子源电压4.5 kV，毛细管电压35 V，Tube lens 110 V， 鞘气30 arb，辅助气10 arb，二级离子采用碰撞诱导解离（CID）数据采集，CID归一化能量35%.
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对照品溶液：精密称取蔗糖、棉子糖及甘露三糖对照品各适量，分别置10 mL量瓶中，加水2mL超声溶解后用乙腈稀释至刻度，摇匀. 制备每1 mL约含蔗糖0.04 mg、棉子糖0.15 mg、甘露三糖0.2 mg的混合溶液.
供试品溶液: 水苏糖样品适量精密称定，加水适量超声溶解，放冷，用乙腈定量稀释制成每1mL约含20 mg溶液.
对照溶液 精密量取供试品溶液适量，用流动相定量稀释制成每1mL约含200 μg的溶液.
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结合水苏糖及其他成分的结构性质，选用氨基柱进行方法建立及分析. 通过比较月旭公司的Xltimate XB NH2柱、Waters公司的Spherisorb NH2柱及XBridge BEH Amide柱对水苏糖提取物的分离效果，最终选用酰胺基色谱柱（XBridge BEH Amide，4.6 mm×250 mm，5 μm）. 在初步建立的水苏糖分离方法中，对流动相组成及比例进行考察，分别尝试乙腈:水=70:30、65:35、75:25等比例，结果显示，在乙腈:水=70:30条件下，水苏糖及其他成分分离度更佳.
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水苏糖LOQ为0.1054 μg·mL−1，供试品浓度20 mg·mL−1时，相当于水苏糖含量0.0005%的杂质可被准确定量.
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本研究中采用建立的HPLC-CAD法对水苏糖提取物中的微量成分进行分析（图1）. 根据水苏糖提取物不同组分含量情况（相对水苏糖峰面积＞0.3%），采用保留时间、高分辨质量数、二级碎片信息、质量数偏差值等信息，结合对照品色谱定位及相关文献报道对色谱峰对应的化合物进行鉴定，鉴定结果见表1.
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考虑定量方法准确性及对照品获取情况，蔗糖、棉子糖及甘露三糖采用外标法定量. 毛蕊花糖通过计算确定其校正因子为1.23. 根据中国药典分析检测技术指南要求，当校正因子超出0.9—1.1范围时，可采用加校正因子的主成分自身对照法进行定量. 杂质4、6与毛蕊花糖分子量相同，在无法获得对照品情况下，亦采用加校正因子的自身对照法进行定量分析.
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精密称取样品约200 mg，在建立的方法条件下，空白溶液不干扰检测，各杂质峰与蔗糖、棉子糖、甘露三糖和毛蕊花糖色谱分离良好. 在酸、碱、氧化、高温及光照强制降解条件下，各杂质峰分离度良好. 水苏糖主成分在强酸强碱（2 mol·L−1氢氧化钠溶液和2 mol·L−1盐酸溶液）条件下降解较为明显，提示样品在存储及保存过程中应避免与强酸及强碱接触.
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取混合对照品溶液，按1.2节的液相色谱条件连续进样6 次，记录峰面积. 蔗糖、棉子糖、甘露三糖峰面积的RSD分别为0.89%、0.58%及1.65%. 取6份供试品溶液进行重复性实验，结果显示蔗糖含量RSD=0.87%，棉子糖含量RSD=0.75%，甘露三糖含量RSD=0.98%，毛蕊花糖含量RSD=0.96%，最大单杂含量RSD=0.80%，总杂含量RSD=0.94%.
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采用建立的HPLC-CAD方法对对照品系列浓度溶液进行测定. 各分析物的峰面积（Y）和对应的质量浓度（X，μg·mL−1）呈现线性相关，结果表明，各组分在对应的浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0. 999。以色谱峰S/N≥3和10 时目标物的浓度作为方法的检出限和定量限（见表2）.
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取各溶液适量分别在室温条件下放置0、2、4、6、8、10、12 h，蔗糖峰面积RSD=0.66%；棉子糖峰面积RSD=0.30%；甘露三糖峰面积RSD=0.46% ；毛蕊花糖含量RSD=0.82%；最大单杂含量RSD=0.37%；杂质总量RSD=0.35%. 供试品溶液中各组分在室温条件下12 h内稳定性良好.
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精密称取各成分对照品适量，按1.3节方法制备3浓度9份供试品加标溶液，连续进样检测，记录峰面积. 在限度浓度的80%—120%范围内，蔗糖平均回收率为100.1%，RSD=2.09%（n=9）；棉子糖平均回收率为103.4%，RSD=1.09%（n=9）；甘露三糖平均回收率为100.4%，RSD=2.49%（n=9）.
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当流速、柱温及不同批次的色谱柱等条件微小变化时，蔗糖含量变化RSD=1.39%，棉子糖含量变化RSD=0.67%，甘露三糖含量变化RSD=1.1%，毛蕊花糖含量变化RSD=6.41%，最大单杂含量变化RSD=4.44%及杂质总量变化RSD=2.67%.
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采用建立的方法对3批水苏糖提取物进行检测，分别精密称取样品粉末200 mg，测定蔗糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊花糖及未知杂质的含量（见表3）. 结果表明，样品中蔗糖、棉子糖、甘露三糖和毛蕊花糖含量分别为0.07%—0.08%、0.51%—0.56%、0.35%—0.37%和0.43%—0.47%，最大单杂在0.45%—0.46%，各杂质成分在不同批次间较为一致.
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本文利用高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-LTQ/Orbitrap-MS）结合HPLC-CAD鉴定了水苏糖提取物中含量相对较高（＞0.3%）的6种寡糖成分，确定了水苏糖提取物中包括蔗糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊花糖及其两种异构体等微量组分. 采用酰胺柱建立了水苏糖提取物中微量组分分离的HPLC分析方法，并应用CAD检测器对4种已知寡糖组分和两种未知四糖组分进行定量检测. 方法建立过程显示CAD检测器在微量寡糖组分检测中，质量浓度和响应信号之间呈现线性相关，能够较为简单完成微量组分定量.
目前高效液相色谱法广泛用于糖类物质的检测. 由于糖类成分没有发色官能团，紫外吸收较弱或几乎没有吸收，示差折光检测器（RID）在糖类研究中应用较多，但检测结果受流动相比例、温度、流速等方面影响较大，且不能采用梯度洗脱，存在一定局限性。蒸发光散射检测器（ELSD）可以进行梯度洗脱，但由于其检测原理特点，方法灵敏度较低，耐用性和稳定性不佳. CAD检测器作为一种新型质量型检测器，其响应值不依赖于分析物的结构，灵敏度更高，已逐步被用于糖类物质分析. 在本文方法中，CAD检测器呈现出较为灵敏的响应，在0.1105—0.7649 μg·mL−1内的微量组分可被有效检出. 方法学验证显示，该方法线性范围宽，灵敏度高，准确度好. 建立的方法可用于水苏糖提取过程中的质量控制，为水苏糖质量研究提供方法依据.
高效液相色谱联用高分辨质谱和电喷雾检测器定性和定量检测水苏糖提取物中寡糖成分
Qualitative and quantitative analysis of oligosaccharides in stachyose extract by high performance liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry and charged aerosol detector
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摘要: 本文建立了高效液相色谱联用电喷雾检测器（HPLC-CAD）检测水苏糖中寡糖成分的方法. 利用高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-LTQ/Orbitrap-MS）鉴定了水苏糖中包括蔗糖、棉子糖、甘露三糖和毛蕊花糖等多种寡糖成分. 方法采用XBridge BEH Amide色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），乙腈-水（70:30）为流动相进行测定. 结果表明，蔗糖、棉子糖、甘露三糖质量浓度与峰面积分别在2.763—110.5 μg·mL−1、9.906—396.2 μg·mL−1和12.24—489.5 μg·mL−1范围内呈现良好线性关系（r＞0.999），平均回收率（n=9）为100.1%—103.4%，RSD为1.09%—2.49%. 该方法灵敏度高，准确性好，操作简便，可用作水苏糖提取物质量控制的有效方法.Abstract: A method for the determination of oligosaccharides in stachyose by high performance liquid chromatography with charged aerosol detector (HPLC-CAD) was established. High performance liquid chromatography linear ion trap/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (HPLC-LTQ/Orbitrap MS) was used to identify a variety of oligosaccharides in stachyose, including sucrose, raffinose, mannotriose and verbascose. The method Used XBridge BEH amide chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5.0 μm), acetonitrile and water (70:30) as the mobile phase for quantitative determination. The results showed that sucrose, raffinose and mannose have a good linear relationship (r＞0.999) within 2.763—110.5 μg·mL−1, 9.906—396.2 μg·mL−1 and 12.24—489.5 μg·mL−1. The average recoveries (n=9) were 100.1%—103.4%. The RSD were 1.09%—2.49%. The method has high sensitivity, good accuracy and simple. It can be used as an effective method for the quality control of stachyose extract.
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表 1 水苏糖原料中主要成份信息
Table 1. Main compounds in Stachyose
No. 理论分子量 [M+Na]+ 实测分子量[M+Na]+ 可能元素组成 偏差值 二级碎片MS2 推测成份 1 365.10543 365.10477 C12H22O11Na −1.404 203.00/184.99 蔗糖 2 527.15826 527.15765 C18H32O16Na −1.377 365.18 棉子糖 3 527.15826 527.15778 C18H32O16Na −1.035 365.23/467.17 甘露三糖 4 851.26390 851.26257 C30H52O26Na −0.485 689.32/527.28 — 5 851.26390 851.26331 C30H52O26Na −0.625 689.31 毛蕊花糖 6 851.26390 851.26306 C30H52O26Na −1.060 527.25 — 
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表 2 水苏糖提取物中各成分线性及灵敏度考察
Table 2. Investigation on linearity and sensitivity of components in stachyose
组分 线性范围/（μg·mL−1） 线性方程 r LOD/（μg·mL−1） LOQ/（μg·mL−1） 蔗糖 2.763—110.5 Y=0.0747X−0.1416 0.9998 0.1105 0.2210 棉子糖 9.906—396.2 Y=0.0624X−0.2635 0.9998 0.2476 0.4953 甘露三糖 12.24—489.5 Y=0.0368X−0.4150 0.9997 0.7649 1.530 水苏糖 46.44—495.3 Y=0.1351X−0.4363 0.9997 0.0527 0.1054
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表 3 不同批次水苏糖提取物中各成分含量测定
Table 3. Determination of each component in different batches of stachyose extract
样品批号 蔗糖/% 棉子糖/% 甘露三糖/% 毛蕊花糖/% 最大单杂/% 杂质总量/% 201810131 0.07 0.51 0.37 0.43 0.45 0.72 201810132 0.08 0.56 0.36 0.47 0.46 0.75 201810133 0.08 0.55 0.35 0.47 0.46 0.75
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