邻苯二甲酸酯类(phthalate esters, PAEs)是一类用途广泛的工业化学品，作为增塑剂以软化聚氯乙烯产品[1]。PAEs是目前世界上生产量大、应用面广的人工合成有机化合物之一，是一类重要的环境激素类化合物。近年来，随着工业生产和塑料制品的大量使用，导致PAEs在大气、水体和土壤等自然环境中普遍存在[2]。PAEs类物质目前已广泛存在于人体组织中，对人体健康产生极大危害。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)将6种PAEs列为优先控制污染物，包括邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate, DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸苄基丁酯(benzyl butyl phthalate, BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)和邻苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate, DNOP)[3]。已有研究证明，PAEs的毒理学效应主要有类雌激素效应，生殖毒性、发育毒性以及其他毒性[4]。此外，暴露于DEHP的啮齿类动物的肝细胞发生癌变，促进线粒体增殖、凋亡等[5]。
肝脏是PAEs毒性的靶器官，PAEs暴露会影响肝功能[6]。而线粒体在肝细胞中含量丰富，当肝细胞暴露于PAEs时，线粒体生物发生障碍[7]。线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, Tfam)是调控线粒体生物发生最重要的调控因子之一，参与线粒体DNA(mtDNA)复制、转录以及拷贝数的调节[8]。Tfam缺失会导致线粒体生物发生的降低和线粒体功能障碍，而线粒体作为“细胞能量工厂”，当线粒体生物合成降低时，线粒体向细胞传递危险信号，最终导致细胞走向死亡[9]。但关于PAEs是如何影响Tfam蛋白相对表达量的研究甚少。通过PAEs对Tfam蛋白相对表达量的影响，可进一步预测PAEs对HepG2细胞线粒体的影响。然而，由于PAEs类似物种类多，逐一测其对Tfam蛋白的影响较为繁杂。
三维定量构效关系(three dimension quantitative structure-activity relationship, 3D-QSAR)是以配体和靶点的三维结构为基础，根据分子的内能变化和分子间的相互作用的能力变化，预测化合物的活性[10]，通过以部分有机化合物的生物毒性数据与结构参数进行统计建模，进而预测其他结构类似化合物的生物毒性，是当前环境化学领域的一个前沿课题[11]。基于上述背景，本文通过测定PAEs对HepG2细胞线粒体中Tfam蛋白相对表达量的影响，采用比较分子相似法(comparative molecular similarity indices analysis, CoMSIA)构建定量结构-活性关系模型，揭示不同结构的PAEs对HepG2细胞的线粒体毒性影响，为更好地对环境污染风险进行评估以及设计新型无毒的PAEs提供有利的数据支撑。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 实验材料
人源肝癌细胞系HepG2细胞及MEM(minimum essential medium)培养基购自中国武汉普诺赛有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、6种邻苯二甲酸酯类化合物(种类见表2，纯度均≥99%)购自Sigma-Aldrich公司；RIPA裂解液、BCA蛋白试剂盒购于中国上海碧云天公司；Anti-GAPDH抗体购自Affinity；Anti-Tfam抗体购自Cell Signal Technology。
1.2 细胞培养及处理
细胞培养基选择MEM完全培养基，其中添加10%(V∶V)的胎牛血清、1%(V∶V)青霉素链霉素以及1%(V∶V)L-谷氨酰胺，放入37 ℃，5%(V∶V)CO2的培养箱，隔天更换培养液。当细胞达到对数生长期，以此阶段细胞作为实验细胞。准确称取一定量的邻苯二甲酸酯类化合物溶于DMSO中，使最终母液浓度为1 mol·L-1，后经过滤除菌后保存于-20 ℃中。
取对数期细胞接种于6孔板中，根据前期细胞毒性实验研究[12]，24 h贴壁后用不同浓度的PAEs(0、125、250、500和1 000 μmol·L-1)作用48 h。
1.3 蛋白免疫印迹法
将预处理后的细胞置于冰上，用含PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，并将其收集于EP管中，离心。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清液的蛋白质浓度。然后在10%(V∶V)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(SDS-PAGE)上电泳等量的蛋白质。蛋白分离后，将凝胶转到PVDF膜上，并使用5%的脱脂奶粉于室温下封闭1.5 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育过夜。随后，于室温条件下将PVDF膜与二抗孵育1.5 h。最后，通过ECL显色，通过软件Image J软件对其灰度进行量化分析。
1.4 三维定量构效关系建模与分析
本实验采用SYBYL2.1.1软件各模块完成，利用CoMSIA法进行3D-QSAR分析。以分子的最低能量构象作为优势稳定构象，对每个分子在Tripos力场中用分子程序Minimize进行能量优化，分子电荷采用Gasteiger-Huckel电荷，用Powell能量梯度法，最大优化次数为1 000，能量收敛限定为0.005 kJ·mol-1。以化合物DBP、DEP和DNOP为预测集，检验模型的预测能力，其余的PAEs化合物作为训练集。
利用偏最小二乘(PLS)进行留一法(LOO)交叉验证得到内部交叉验证系数(Q2)以及最佳主成分数(n)，并以非交叉验证方法计算出模型的非交叉验证相关系数(R2)、并计算标准偏差(SEE)、Fisher检验值(F)以及各分子场的贡献值。
1.5 CoMSIA模型的外部验证及应用域
通过Golbraikh-Tropsha统计方法来评价QSAR模型的外部预测能力[13]。采用KNIME Analytics Platform进行上述分析。通过Enalos KNIME节点预测QSAR模型的拟合质量与预测能力，对于本文引入的外部预测能力评价方法，所建立的模型必须满足以下条件[14]：
式中：R2为预测与观察到的活性之间的相关性系数；
为外部交叉验证相关性系数；
为判定系数(预测与观察到的活动)；
为判定系数(观察到相对于预测的活动)；k为斜率(预测与观察到的活动回归穿过原点的线)；k’为斜率(穿过原点的观测活动与预测活动的回归线)。
该QSAR模型的适用范围通过杠杆值(leverage, h)的Williams图(即标准化与杠杆值)来表征[13]，其中标准化残差为δ、杠杆值为h、警告杠杆值为h*。标准化残差的绝对值>3的化合物即被定义为异常值，若预测的PAEs类化合物残差在这个范围内，即可说明所建立的QSAR模型预测是可靠的。关于Williams图中的δ与h、h*计算公式如下：
式中：xi为目标化合物的模型变量所形成的向量，X为训练集的自变量矩阵。
2 结果与分析(Results and analysis)
2.1 PAEs对HepG2细胞中Tfam蛋白表达量的影响
6种PAEs对HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量的影响如图1所示，当PAEs以低浓度作用于HepG2细胞48 h后，其中DEP在作用浓度为125 μmol·L-1时增加Tfam蛋白相对表达量，其余PAEs化合物在低浓度对Tfam蛋白相对表达量的影响不显著。然而，当PAEs的浓度为1 000 μmol·L-1时，均降低HepG2细胞中Tfam蛋白的相对表达，其中DBP、DMEP、DNOP、DEHP对Tfam蛋白相对表达量影响较大(P<0.01)，且经DBP、DNOP作用的HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量较其余4种PAEs低，提示DBP、DNOP对HepG2细胞的线粒体毒性相对较强。
本课题组前期研究发现，经PAEs作用的HepG2细胞，其Tfam蛋白表达水平有显著下降的趋势[15-16]。本研究中，PAEs化合物对Tfam蛋白相对表达量的影响表现出一定差异，但当PAEs的作用浓度为1 000 μmol·L-1时，均降低Tfam蛋白相对表达量，因此在后续研究不同结构的PAEs对HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量的影响以1 000 μmol·L-1进行建模。PAEs是由邻苯二甲酸酐与醇类化合物在一定的条件下酯化形成，其多样性表现于醇类化合物不同的侧链基团[17]，其结构有一定的差异性，因此接下来意在通过CoMSIA方法分析PAEs对HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量的影响以及PAEs分子结构在调控线粒体生物发生中的作用，预测PAEs结构差异对HepG2细胞的线粒体毒性影响。
2.2 PAEs与HepG2细胞中Tfam的定量构效关系
2.2.1 CoMSIA模型的评估和验证
通过PLS计算和分析，得出CoMSIA模型的评估参数和分子贡献率(表1)。CoMSIA模型的最佳组件数(n)为3，交叉验证相关系数(Q2)为0.508，非交叉验证相关系数(R2)为0.983，SEE为0.017，Fisher验证值为37.962。由于模型的Q2>0.5且R2>0.9，表明模型具有良好的预测能力及拟合能力[18-19]。6种PAEs化合物的实验值和预测值见表2，并根据两者的关系构建线性回归图。如图2所示，模型的预测值与实验值高度吻合，斜率为0.9316，且预测值与实验值之间的决定系数为0.9823，即表明所构建的CoMSIA具有较高的内部预测能力，可以用于预测PAEs对Tfam蛋白相对表达量的影响，进一步预测对HepG2细胞的线粒体毒性。
图1 邻苯二甲酸酯类(PAEs)以浓度为125、250、500和1 000 μmol·L-1处理48 h对HepG2细胞中Tfam相对表达量的影响
注：(a) 经PAEs作用的Western blot条带，(b) 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，(c) 邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，
(d) 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，(e) 邻苯二甲酸二(2-乙基)酯(DEHP)，(f) 邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)，
(g) 邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)；n=3；与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
Fig. 1 Effects of phthalate esters (PAEs) on the relative expression of Tfam in HepG2 cells treated
with 125, 250, 500, 1 000 μmol·L-1 for 48 h
Note: (a) Western blot strips of PAEs treatment groups, (b) Dibutyl phthalate (DBP), (c) Dimethyl phthalate (DMP), (d) Diethyl phthalate (DEP),
(e) Bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), (f) Di-n-octyl phthalate (DNOP), (g) Bis(2-methoxyethyl) phthalate (DMEP); n=3;
compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.
在CoMSIA模型中，立体场、静电场、疏水场、氢键供体场及氢键受体场的贡献分别为11.90%、29.60%、30.90%、0.00%和27.60%，即提示空间效应、带电基团分布、疏水效应和氢键供体均影响Tfam蛋白相对表达量。
2.2.2 外部预测能力
Enalos模型可接受性标准KNIME节点已应用于数据，满足Golbraikg-Tropsha[14]方法的条件，其预测与观察到的活性之间的相关性系数(R2)为1.0，外部交叉验证相关性系数
为0.997，相关判定系
图2 实验测定与模型预测的Tfam蛋白相对表达量
之间的线性回归分析
Fig. 2 Linear regression analysis between experimental data
and predicted data of Tfam protein relative expression
数之间的关系满足(R2-R02)/R2<0.1及
穿过原点的回归线斜率k为1.007、k’为0.993，均满足接近1的条件，该模型通过预测能力测试。通过以上数据可知该3D-QSAR模型具有良好的外部预测能力。
2.2.3 应用域
Williams图一般用于评价所建立QSAR模型的应用域，在Williams图中，当数据点杠杆值(h)大于警告杠杆值(h*)时，表明该数据点可能影响模型，标准化残差的绝对值>3的化合物即被认为是响应离群值[19]。如图3所示，实验所得PAEs数据点的h均小于h*且其标准化残差的绝对值全部落入(-3, 3)的阈值范围内，表明该模型具有良好的预测结果，能够覆盖广泛的结构应用域。
表1 CoMSIA模型的统计参数
Table 1 The statistical parameters of CoMSIA models
Q2R2SEEFn贡献值/% Contribution/%立体场Steric静电场Electrostatic疏水场Hydrostatic氢键供体场Donor氢键受体场Acceptor0.5080.9830.01737.962311.9029.6030.900.0027.60
注：Q2表示交叉验证相关系数；R2表示非交叉验证相关系数；SEE表示标准偏差；F表示Fisher验证值；n表示模型的主成分数。
Note: Q2 stands for the cross validation coefficient; R2 stands for the non-cross validation coefficient; SEE stands for the standard deviation; F stands for the Fisher verification value; n stands for the number of principal components of the model.
表2 PAEs对HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量的实验值与模型分析值
Table 2 The experimental and model-predicted values of Tfam protein relative expression in HepG2 cells by PAEs
名称NamesCAS结构Structures实验值Exp.CoMSIAPred.残差Res.邻苯二甲酸二甲酯DMP131-11-30.66920.6580.0112邻苯二甲酸二乙酯DEP84-66-20.79950.7980.0015邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯DMEP117-82-80.75640.758-0.0016邻苯二甲酸二丁酯DBP84-74-20.6040.623-0.019邻苯二甲酸二正辛酯DNOP117-84-00.60130.5920.0093邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯DEHP117-81-70.72830.73-0.0017
2.2.4 基于DNOP物质对CoMSIA模型三维等高图进行分析
根据图4中DNOP的基本骨架，结合CoMSIA模型图(图5)，探究PAEs分子结构对Tfam蛋白相对表达量的影响。
在立体场中，R与R’基团中主链上出现黄色色块，即表明在主链上其基团体积越大，Tfam蛋白相对表达量减少。但在R与R’基团中侧链上出现绿色色块，即表明在侧链上若存在大体积的基团，将促进Tfam蛋白相对表达，例如化合物DEHP，其R与R’基团中侧链引入乙基，对比相同分子量的DNOP，DNOP在R与R’基团上无侧链，因此经DEHP作用的HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量增加，且绿色色块占主导作用。
图3 模型的应用域
Fig. 3 Application domain of model
图4 邻苯二甲酸酯类的基本骨架
Fig. 4 Basic skeleton of phthalate esters
图5 DNOP在CoMSIA模型的三维等高线图
注：(a)立体场；(b)静电场；(c)疏水场；(d)氢键受体场。
Fig. 5 DNOP’s three-dimensional contour maps in the CoMSIA model
Note: (a) The steric field; (b) The electrostatic field; (c) The hydrophobic field; (d) The acceptor field.
在静电场中，在3、4号位上出现大面积的蓝色色块，即在上述位点引入正电基团会导致Tfam蛋白相对表达量增加。在R与R’基团上出现红色色块，当R与R’基团为负电基团时，增加Tfam蛋白相对表达量，例如化合物DMEP，其R与R’基团引入电负性较强的甲氧基，对比物质DBP在R与R’基团上引入电负性较弱的甲基，因此经DMEP作用的HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量增加。
在疏水场中，苯环上及R与R’基团出现大面积的黄色色块，即在上述位点上增加疏水基团会增加Tfam蛋白相对表达量，由于烷基是疏水基团，因此在R与R’基团上连接的烷烃链越长，其疏水性越强，Tfam蛋白相对表达量增加。例如物质DEHP是由邻苯二甲酸酐与2-乙基己醇结合形成的物质，其R与R’基团疏水性较强，因此Tfam蛋白相对表达量较高。
在氢键受体场中，红色色块主要出现在3、4号位上，紫红色主要出现在R与R’基团上，即说明在R与R’基团上增加氢键受体，Tfam蛋白相对表达量增加。由于氢键供体场的贡献率为0，因此本文未出现氢键供体场的等高线图。例如化合物DMEP，此物质是由邻苯二甲酸酐与甲氧基乙醇在酸性条件下酯化而成，在R与R’基团上引入了2对孤对电子，即多了2个氢键受体，所以经DMEP作用的HepG2细胞中的Tfam蛋白相对表达量增加。
有研究表明DMP、DNOP的R与R’基团上引入疏水基团，能够降低PAEs的毒性[20]，此结果与本研究结果类似，可推测当在PAEs的支链引入疏水基团时，Tfam蛋白相对表达量增加，进一步降低PAEs的线粒体毒性。近些年，在改善PAEs结构、设计环境友好型塑化剂的研究中发现，在邻苯二甲酸酯类支链引入大体积、疏水性强、负电基团和增加氢键受体能够降低PAEs的毒性[20]。
3 讨论(Discussion)
本研究结果显示，当PAEs以1 000 μmol·L-1的浓度作用于HepG2细胞48 h后，与对照组相比其Tfam蛋白相对表达量显著下降，通过3D-QSAR方法定量分析了PAEs对Tfam蛋白相对表达量的影响，该3D-QSAR模型具有良好的内、外部预测能力且具有覆盖此类结构的广泛应用域。
此外，定量构效关系结果表明，在PAEs类中R与R’基团上引入电负性大、疏水性强、氢键受体多的基团，增加PAEs类物质处理组HepG2细胞中Tfam蛋白相对表达量，影响HepG2细胞中线粒体生物发生，降低PAEs对HepG2细胞的线粒体毒性。通过对6种PAEs化合物对Tfam蛋白相对表达量的影响进一步预测此类物质对HepG2细胞的线粒体毒性效应和定量构效关系，为预测新型PAEs对Tfam的影响提供了一个潜在的工具，并为今后设计无毒的新型PAEs提供参考。
通讯作者简介：柳春红(1968—)，女，博士，教授，主要研究方向为食品营养与毒理学。
[1] 曹龙, 张朝升, 陈秋丽, 等. 邻苯二甲酸酯的环境污染和生态行为及毒理效应研究进展[J]. 生态毒理学报, 2018, 13(2): 34-46
Cao L, Zhang C S, Chen Q L, et al. Progress in the study of environmental pollution and ecological behavior and toxicological effects of phthalate ester [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2018, 13(2): 34-46 (in Chinese)
[2] Zeng F, Cui K Y, Xie Z Y, et al. Occurrence of phthalate esters in water and sediment of urban lakes in a subtropical city, Guangzhou, South China [J]. Environment International, 2008, 34(3): 372-380
[3] Tan G H. Residue levels of phthalate esters in water and sediment samples from the Klang River Basin [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1995, 54(2): 171-176
[4] 苗万强, 陈瑶, 安迪, 等. PAEs的污染现状和防治对策[J]. 黑龙江环境通报, 2019, 43(4): 80-83
Miao W Q, Chen Y, An D, et al. Research on pollution status and control measure of PAEs [J]. Heilongjiang Environmental Journal, 2019, 43(4): 80-83 (in Chinese)
[5] Center for the Evaluation of Risks to Human Reproduction. NTP-CERHR Expert Panel Report on Butyl Benzyl Phthalate [R]. Center for the Evaluation of Risks to Human Reproduction, 2000: 1-54
[6] El-Shinnawy N A. The therapeutic applications of celery oil seed extract on the plasticizer di(2-ethylhexyl) phthalate toxicity [J]. Toxicology and Industrial Health, 2015, 31(4): 355-366
[7] Parisi M A, Clayton D A. Similarity of human mitochondrial transcription factor 1 to high mobility group proteins [J]. Science, 1991, 252(5008): 965-969
[8] 张蕊. 线粒体转录因子A对肿瘤细胞辐射敏感性的影响及相关机制研究[D]. 合肥: 中国科学技术大学, 2019: 11-13
Zhang R. The effects and mechanisms of mitochondrial transcription factor A on tumor radiation sensitivity [D]. Hefei: University of Science and Technology of China, 2019: 11-13 (in Chinese)
[9] 申屠路媚, 牟艳玲. 线粒体功能障碍机制及其相关疾病研究进展[J]. 生命科学, 2018, 30(1): 87-93
Shentu L M, Mu Y L. Research progress in mitochondrial dysfunction and its related diseases [J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2018, 30(1): 87-93 (in Chinese)
[10] 黄旭, 温演庆, 罗杨, 等. 苯胺苯酚类皮革化学品毒性3D-QSAR研究[J]. 皮革与化工, 2013, 30(6): 1-5
Huang X, Wen Y Q, Luo Y, et al. Study on the 3D-QSAR of toxicity of anilines and phenols used in leather chemicals [J]. Leather and Chemicals, 2013, 30(6): 1-5 (in Chinese)
[11] 李敏, 殷茂娇, 朱娟娟, 等. 卤代肉桂酸对羊角月牙藻的急性毒性及3D-QSAR研究[J]. 生态毒理学报, 2019, 14(4): 175-182
Li M, Yin M J, Zhu J J, et al. Acute toxicity and 3D-QSAR studies on halogenated cinnamic acids to microalga Selenastrum capricornutum [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2019, 14(4): 175-182 (in Chinese)
[12] Liu H, Huang H Y, Xiao X M, et al. Effects of phthalate esters (PAEs) on cell viability and Nrf2 of HepG2 and 3D-QSAR studies [J]. Toxics, 2021, 9(6): 134
[13] Golbraikh A, Tropsha A. Beware of Q2! [J]. Journal of Molecular Graphics & Modelling, 2002, 20(4): 269-276
[14] Xiao R Y, Ye T T, Wei Z S, et al. Quantitative structure-activity relationship (QSAR) for the oxidation of trace organic contaminants by sulfate radical [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(22): 13394-13402
[15] 卜玲玲, 刘焕, 杨娇, 等. DEHP经sirt1/pgc-1a通路诱导的HepG2细胞线粒体损伤效应[J]. 中国环境科学, 2020, 40(8): 3621-3626
Bu L L, Liu H, Yang J, et al. DEHP induced mitochondrial damage through sirt1/pgc-1a pathway in HepG2 cells [J]. China Environmental Science, 2020, 40(8): 3621-3626 (in Chinese)
[16] Liu H, Zhu S Y, Han W N, et al. DMEP induces mitochondrial damage regulated by inhibiting Nrf2 and SIRT1/PGC-1α signaling pathways in HepG2 cells [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 221: 112449
[17] 张悦, 袁骐, 蒋玫, 等. 邻苯二甲酸酯类毒性及检测方法研究进展[J]. 环境化学, 2019, 38(5): 1035-1046
Zhang Y, Yuan Q, Jiang M, et al. Research progress in toxicity and detection methods of phthalic acid esters [J]. Environmental Chemistry, 2019, 38(5): 1035-1046 (in Chinese)
[18] Babu S, Sohn H, Madhavan T. Computational analysis of CRTh2 receptor antagonist: A Ligand-based CoMFA and CoMSIA approach [J]. Computational Biology and Chemistry, 2015, 56: 109-121
[19] Du M J, Qiu Y L, Li Q, et al. Efficacy coefficient method assisted quadruple-activities 3D-QSAR pharmacophore model for application in environmentally friendly PAE molecular modification [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2020, 27(19): 24103-24114
[20] Zhang H G, Zhao C J, Na H. A modified 3D-QSAR model based on ideal point method and its application in the molecular modification of plasticizers with flame retardancy and eco-friendliness [J]. Polymers, 2020, 12(9): 1942