我国是抗生素的生产和使用大国，在医学、畜牧业和水产养殖等领域中应用广泛[1]。随着抗生素使用量的日益增加，我国地表水中频繁检出大量抗生素，其中氧氟沙星(OFL)和磺胺甲恶唑(SMX)含量较高[2-3]。环境中长时间存在的抗生素会对生态环境和人类健康造成潜在威胁。研究发现，OFL单独暴露会引起斑马鱼氧化损伤[4]；SMX单独暴露影响了斑马鱼胚胎生长，还诱导了氧化应激和炎症[5]。水环境中的抗生素通常以混合形式存在，低浓度混合抗生素对水生生物产生的联合毒性需要重视[6-7]。据报道，SMX单独暴露后普通小球藻的96 h-EC50为1 672.71 μg·L-1，而在恩诺沙星和SMX联合暴露后的96 h-EC50为141.3 μg·L-1，其联合毒性效应比单独暴露更为严重[8]。OFL和SMX在环境水体中广泛存在，并被频繁同时检出，环境浓度均在纳克和微克级别。例如，浑河同时检出OFL (nd～32.1 ng·L-1)和SMX (nd～25.3 ng·L-1)[9]；在海口市同时检出OFL (100.9～499.8 ng·L-1)和SMX (711.7～1 385.8 ng·L-1)[10]。鱼类的整个生命周期都处于水环境中，故研究OFL和SMX对鱼类的联合毒性更具现实意义。
抗生素对鱼类为低毒性，虽不直接影响鱼的存活，但机体内的活性氧物质(ROS)的产生与消除会失衡，导致氧自由基在细胞内过量储蓄引起氧化应激[11]，继而导致鱼体出现氧化损伤、脂质过氧化、蛋白质损伤、DNA表达变化和酶失活等现象[6]。抗氧化酶是重要的ROS清除物质[12]，是保护鱼体的重要屏障。在鱼体抗氧化系统中，酶类抗氧化剂包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)等，在机体受到氧化应激损害时，会通过酶促系统来清除自由基[12-13]。而丙二醛(MDA)作为生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终产物，可以反应脂质过氧化的水平[14]。
此外，热休克蛋白对细胞应激防御也至关重要，参与机体抗氧化酶活力的调控[15]。热休克蛋白70(HSP70)和热休克蛋白90(HSP90)与促进应激细胞恢复等生理功能有关，能够通过抑制自由基生成关键酶的活性来减少ROS的产生[16]。Nrf2核转录因子在活性氧清除和氧化应激过程中也处于关键地位，调节多种抗氧化酶的表达及相关基因的转录[17]，其下游基因CAT、Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD2)、醌氧化还原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸合成酶催化亚基(GCLC)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)都有助于清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤[18]。孕烷受体(PXR)是机体针对有毒物质适应性防御和解毒代谢的重要组成部分，能被抗生素激活[19]。因此，可通过这些抗氧化酶及MDA含量和相关基因mRNA表达的变化，指示联合抗生素的毒性影响。
食蚊鱼(Gambusia affinis)是一种小型的卵胎生淡水鱼类，是生态毒理学的模式实验动物之一。在鱼类的诸多组织中，肝脏作为鱼类解毒的主要器官，肠道作为抗生素的主要吸场所[20]，肌肉组织是检出抗生素残留的常见部位[21]，对抗生素毒性响应具有代表性，可重点考察联合抗生素对这些组织的影响。本研究通过测定食蚊鱼肝脏、肠道、肌肉组织抗氧化酶活力和相关基因mRNA的表达变化，从蛋白质和mRNA表达水平2个层次，共同探究抗生素OFL和SMX联合暴露对食蚊鱼的氧化损伤；结合主成分分析(PCA)和Spearman相关性分析识别反应灵敏的指标，为混合抗生素的毒性评价提供研究基础。
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 试验动物
本研究所用食蚊鱼购自广西荔浦青山水产养殖场，在实验室水生生物养殖系统内驯养2周，水温为(24±2) ℃，光周期为14 h∶10 h(白昼/黑暗)，早晚固定喂食2次丰年虾卵并及时吸出残饵和排泄物。选取健康、活泼和大小均匀的成年雌鱼投入试验，鱼体平均体质量为(0.16±0.05) g，平均体长为(2.23±0.19) cm。
1.2 OFL和SMX联合暴露实验
OFL(纯度>98%)和SMX(纯度>98%)，均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，纯度≥99.5%，购自西陇科学股份有限公司。将OFL和SXM用DMSO配制成贮备液备用，暴露液DMSO终浓度为0.0025%(V/V)[22]。本研究设置3个处理组，每组内OFL和SMX按1∶1混合，分别为低浓度组(OFL 50 ng·L-1+SMX 50 ng·L-1)、中浓度组(OFL 1 μg·L-1+SMX 1 μg·L-1)、高浓度组(OFL 20 μg·L-1+SMX 20 μg·L-1)，并设置DMSO对照组(CK)，每组设置3个生物平行。在2 L玻璃烧杯中加入2 L实验溶液，各放入8尾食蚊鱼。实验用水均为曝气2 d以上的自来水，pH为7.1～7.4，水温为(24±2) ℃，溶解氧≥5.0 mg·L-1。采用半静态换水方式，每日更换1/2实验溶液，暴露10 d后，采用冰浴解剖，在体式显微镜下快速取出食蚊鱼的肝脏、肠道和肌肉组织。其中，每个烧杯取3尾鱼的组织置于EP管，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于酶活的测定；另取3尾鱼的组织置入RNA保存液(TaKaRa)中，4 ℃保存过夜后于-20 ℃保存，用于提取总RNA。
1.3 抗氧化酶活力分析
将保存于-80 ℃的组织取出，按照样品质量∶生理盐水体积=1∶9加入预冷生理盐水，再加入灭菌的氧化锆珠，采用匀浆机(JXFSTPRP-48，上海净信实业发展有限公司)进行低温组织匀浆，4 ℃、2 500 r·min-1离心15 min，吸取上清液配制成1%组织匀浆，用于抗氧化酶活力的测定。测定指标SOD、MDA、CAT、GST和总蛋白含量(TP)均使用南京建成生物工程研究所试剂盒，具体操作参照试剂盒说明进行。
1.4 抗氧化相关基因mRNA表达分析
1.4.1 总RNA的提取及cDNA的合成
使用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)参照TRIzol法提取肝脏、肠道和肌肉组织的总RNA。用超微量紫外分光光度计(Quawell Q5000，美国)检测RNA的质量和含量。参照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒将RNA合成第一链cDNA，用于荧光定量PCR实验。
1.4.2 荧光定量PCR
根据食蚊鱼基因序列设计qPCR特异性引物(表1)，以食蚊鱼GAPDH基因作为内参基因[23]，引物由华大基因公司合成。运用荧光定量PCR仪(Applied Biosystems QuantStudio 3)开展实时荧光定量PCR实验。使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒进行qPCR实验，反应总系为10 μL SYBR Premix MixTaq (2×)、上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)、cDNA 2 μL、6 μL ddH2O；反应程序为：预变性50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；40个循环95 ℃、15 s，60 ℃、1 min；熔解曲线95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。反应结束后，查看PCR的扩增曲线和熔解曲线判断PCR反应的特异性。检测OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼肝脏、肠道、肌肉中GST、HSP70、HSP90、PXR、Nrf2、SOD2、NQO1、GCLC和CAT基因的mRNA表达量。其中，CAT主要在肝脏中特异性表达[24]，因此只测定肝脏组织的CAT酶活力和CAT基因mRNA的表达量。
1.5 数据处理
采用2-ΔΔCt法进行基因mRNA相对表达量分析，数c(Mean±SEM)表示。对照组与处理组之间采用t检验，处理组之间采用单因素方差分析(Tukey多重比较)。对测定指标进行主成分分析，同时利用Spearman相关性分析研究抗生素联合胁迫下所测指标之间的相关性。采用Graphpad prism 9和Origin 2019软件进行数据处理和绘图。*表示差异显著P<0.05，**表示差异显著P<0.01,***表示差异显著P<0.001。
2 结果(Results)
2.1 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织中抗氧化酶活力的变化
不同浓度OFL和SMX联合暴露10 d后，食蚊鱼3个组织中抗氧化酶活力均呈现剂量-效应关系(图1)。低浓度组中，食蚊鱼3个组织的SOD活力均有增强(图1(a))。在肝脏组织中：低、中浓度组SOD活力有所增加，中浓度组SOD活力变化显著(P<0.05)，是对照组的2.40倍，高浓度组SOD活力与对照组无显著差异。中浓度组GST活力(图1(b))显著增加(P<0.01)，是对照组的1.66倍，高浓度组出现显著下调(P<0.01)，比对照组降低24%。CAT活力(图1(c))随着抗生素浓度的升高呈现先上升再下降的趋势，低、中浓度组活力显著增加(P<0.05)，分别为对照组的1.44倍和1.99倍，高浓度组CAT活力与对照组无显著差异。MDA含量(图1(d))在低、高浓度组出现显著增加(P<0.001)，分别为对照组的2.62倍和2.67倍，机体出现脂质过氧化，而中浓度组出现MDA含量受抑制(P<0.05)，比对照组下降35%。
表1 目标基因的qPCR引物序列
Table 1 qPCR primer sequence of target genes
目的基因Genes正向引物(5’～3’)Forward primer sequence (5’～3’)反向引物(5’～3’)Reverse primer sequence (5’～3’)CATCCATCTTCTTCATCAGGGACGCGGGTTTGAGGGTTTCGCTTCTGSTTGCTCGCCATCAATCCCAGGAAGCACCGTAGGACTCGTTCAGHSP70TTACTTCAATGACTCCCAGCGTTACTTCAATGACTCCCAGCGGAPDHTTACTTCAATGACTCCCAGCGTCAGGGATGACCTTGCCAACAGHSP90GAGGACCTGCCCCTAAACAGATTCTGGGAGTCTTCGTGGSOD2TACTGGGCACTGACTAAGGAGCGGCATTGATGTATGGGAGCANQO1TCTACTGGTTCAGCGTCCCGAACGACAGCAGAGCCTTCTTGGCLCGACAGGACCCAAGAGGAACGTCCCCACAGCAAGACAGGTAGNrf2CCTGCTGATGGCTGGCTTTACAGATGTGCTCCTGGTTGAATGPXRGCGATCTGGCGAAGGGTTAGCATTTATTCAGGAACGGACAT
图1 氧氟沙星(OFL)和磺胺甲恶唑(SMX)联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织中超氧化物歧化酶(SOD)、
谷胱甘肽S-转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量的变化
Fig. 1 The changes of the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione S-transferase (GST), catalase (CAT), and malondialdehyde (MDA) contents in the different mosquitofish tissues after combined ofloxacin (OFL) and sulfamethoxazole (SMX) exposure for 10 d
在肠道组织中：低浓度组SOD活力显著增加(P<0.01)，是对照组的2.36倍。3个组GST活力均显著增加(P<0.05)。MDA含量在3个组均被显著抑制(P<0.001)。在肌肉组织中：各浓度组总SOD活力和GST活力较对照组均无显著差异，肌肉组织中MDA含量较低，未检出。
总体而言，SOD和GST活力在肝脏和肠道组织中变化明显，肝脏组织中SOD、GST和CAT均呈现“倒U”型，肠道组织中SOD和GST均显著增加。MDA含量在肝脏和肠道中均变化显著，呈现不同的特征，其中，MDA含量在肝脏中呈现“V”型，在肠道中均显著降低。
2.2 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织抗氧化相关基因mRNA表达的变化
在肝脏组织中(图2)，CAT基因mRNA表达量随暴露浓度增加，呈现先升高再下降的趋势。其中，中浓度组CAT基因显著上调(P<0.001)，是对照组的2倍；低、中浓度组GST基因表达无显著变化，高浓度组GST基因表达显著上调(P<0.01)。高浓度组HSP70基因表达显著上调(P<0.0001)，是对照组的1.95倍，而低、中浓度组HSP90基因显著下调(P<0.05)，高浓度组HSP90基因与对照组无显著差异。3个浓度组SOD2基因和NQO1基因mRNA表达量与对照组均无显著差异。低浓度组GCLC基因显著下调(P<0.01)，中浓度组Nrf2基因显著下调(P<0.01)且与高浓度组Nrf2基因表达差异显著(P<0.01)。低浓度组PXR基因显著下调(P<0.01)，中、高浓度组PXR基因与对照组无明显差异。
图2 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼肝脏组织中抗氧化相关基因mRNA表达变化
Fig. 2 mRNA expression levels of antioxidation-related genes in liver tissue of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
在肠道组织中(图3)，低浓度组GST基因和HSP70基因显著下调(P<0.01)，高浓度组HSP70基因显著下调(P<0.01)，而中浓度组HSP70基因与对照组无显著差异。低浓度组HSP90基因显著下调(P<0.05)，高浓度组HSP90基因显著上调(P<0.05)。低浓度组SOD2基因显著下调(P<0.001)，比对照组下降46%。低、中浓度组NQO1基因均显著下调(P<0.05)，分别比对照组下降31%和34%。低浓度组GCLC基因显著下调(P<0.05)，中浓度组GCLC基因与对照组无显著差异，高浓度组GCLC基因显著上调(P<0.01)。3个浓度组Nrf2基因和PXR基因mRNA表达量与对照组均无显著差异。
图3 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼肠道组织中抗氧化相关基因mRNA表达变化
Fig. 3 mRNA expression levels of antioxidation-related genes in intestinal tissue of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
在肌肉组织中(图4)，个体间差异较大。3个浓度组中GST基因、HSP70基因、NQO1基因和GCLC基因mRNA表达量与对照组均无显著差异；中浓度组HSP90基因上调(P<0.05)；低、高浓度组SOD2基因mRNA表达量均显著下调(P<0.01)，分别比较对照组下降37%和52%。中浓度组Nrf2基因显著上调(P<0.05)；低浓度组PXR基因显著下调(P<0.001)，较对照组下降60%，而中浓度PXR基因显著上调(P<0.05)。
图4 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼肌肉组织中抗氧化相关基因mRNA表达变化
Fig. 4 mRNA expression levels of antioxidation-related genes in muscle tissue of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
2.3 主成分分析和相关性分析
根据主成分分析，肝脏组织中，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的累积贡献率为84.73%。在PC1特征向量中，NQO1和HSP90贡献最大；PC2特征向量中，HSP70和CAT贡献最大(图5(a))。肠道组织中，PC1和PC2累积贡献率为87.38%，在PC1特征向量中，GST和SOD2贡献最大；PC2特征向量中，SOD酶和GST酶贡献最大(图5(c))。在肌肉组织中，PC1和PC2累积贡献率为74.98%，在PC1特征向量中，HSP90和GST贡献最大；PC2特征向量中，SOD酶和SOD2贡献最大(图5(e))。综上，肝脏组织NQO1、HSP90和HSP70基因受到的影响较大，肠道组织GST酶及基因、SOD酶及SOD2基因受到较大影响，肌肉组织SOD酶、SOD2基因、HSP90基因受到较大影响。
根据Spearman相关性分析，在肝脏组织中(图5(b))，CAT酶分别与GST酶(ρ=0.904，P=0.002)、SOD酶(ρ=0.778，P=0.023)呈显著正相关，与HSP90基因(ρ=-0.952，P<0.001)、NQO1基因(ρ=-0.810，P=0.015)、Nrf2基因(ρ=-0.738，P=0.037)、PXP基因(ρ=-0.833，P=0.01)呈显著负相关。而HSP90基因分别与SOD酶(ρ=-0.843，P<0.001)、GST酶(ρ=-0.952，P<0.001)、CAT酶(ρ=-0.952，P<0.001)呈显著负相关。GST酶与SOD酶呈显著正相关(ρ=0.754，P=0.03)，与NQO1基因(ρ=-0.905，P=0.002)呈现显著负相关。
图5 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织中抗氧化酶和相关基因主成分分析图及Spearman相关性分析热图
注：(a)、(b)为肝脏组织；(c)、(d)为肠道组织；(e)、(f)为肌肉组织。
Fig. 5 Principal component analysis and Spearman correlation analysis heat map of antioxidant enzymes and related genes in different tissues of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
Note: (a) and (b) are liver tissue; (c) and (d) are intestinal tissue; (e) and (f) are muscle tissue.
在肠道组织中(图5(d))，GST酶与MDA含量(ρ=-0.790，P=0.02)呈现显著负相关，GST基因分别与HSP70基因(ρ=0.737，P<0.001)、HSP90基因(ρ=0.757，P<0.001)、SOD2基因(ρ=0.826，P<0.001)呈显著正相关。HSP90基因分别与SOD2基因(ρ=0.761，P<0.001)和GCLC基因(ρ=0.824，P<0.001)呈现显著正相关。在肌肉组织(图5(f))，GST基因与HSP70基因(ρ=0.930，P<0.001)呈显著正相关，HSP90基因与Nrf2基因(ρ=0.871，P<0.001)呈显著正相关。
综上，通过主成分分析和Spearman相关性分析，在肝脏组织中，抗氧化酶相互之间相关性较强，抗氧化酶活力与相关基因mRNA表达量均呈现负相关。肠道和肌肉组织中各因素相关性较弱。在食蚊鱼肝脏、肠道和肌肉组织中，HSP70基因、HSP90基因、GST酶和GST基因、SOD酶和SOD2基因，在OFL和SMX联合暴露10 d后受到较大影响，可作为混合抗生素的生态毒理指标。
2.4 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼抗氧化酶活力和相关基因的关系
2.4.1 食蚊鱼不同组织中CAT、SOD、GST酶及基因与OFL和SMX联合暴露10 d的相互关系
肝脏组织中，不同浓度组的CAT活力变化与CAT基因的mRNA表达量变化趋势一致(图6(b)，呈现随浓度增加呈现先升高再下降的趋势。SOD酶与SOD2基因在肝脏组织中显著负相关(图6(a))，而在肠道和肌肉组织中无显著相关性(图6(d)、6(f))。GST基因与GST酶均无显著相关性(图6(c)、6(e)、6(g))。
图6 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织中酶与对应基因的关系
注：(a)、(b)、(c)为肝脏组织，(d)、(e)为肠道组织，(f)、(g)为肌肉组织，ρ表示Spearman相关系数，P值表示显著性；CK表示对照组，MIX-L表示OFL 50 ng·L-1+SMX 50 ng·L-1；MIX-M表示OFL 1 μg·L-1+SMX 1 μg·L-1；MIX-H表示OFL 20 μg·L-1+SMX 20 μg·L-1；下同。
Fig. 6 Relationship between enzymes and corresponding genes in different tissues of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
Note: (a), (b), (c) are liver tissue; (d), (e) are intestinal tissue; (f), (g) are muscle tissue; ρ represents Spearman correlation coefficient, and P value represents significance; CK represents the control group, MIX-L represents OFL 50 ng·L-1+SMX 50 ng·L-1; MIX-M represents OFL 1 μg·L-1+SMX 1 μg·L-1; MIX-H represents OFL 20 μg·L-1+SMX 20 μg·L-1; the same below.
2.4.2 食蚊鱼不同组织中Nrf2、PXR及其调控基因对OFL和SMX联合暴露10 d的响应
食蚊鱼肝脏、肠道和肌肉组织中Nrf2及其下游基因CAT、SOD2、NQO1、GCLC和GST在低浓度组时变化趋势相同，均较对照组下调(图7(a)、7(c)、7(e))。GST受到PXR的调控，GST和PXR基因mRNA表达量在3个组织中均呈现出低浓度组表达下调，后随浓度升高又上调的趋势(图7(b)、7(d)、7(f))。在低、中、高3个浓度组联合暴露下Nrf2、PXR及其调控基因在3个组织中呈现相似的随浓度变化趋势。
图7 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼不同组织中Nrf2和PXR及其调控基因的mRNA表达变化趋势
Fig. 7 The mRNA expression trends of Nrf2 and PXR and their regulatory genes in different tissues of mosquitofish after combined OFL and SMX exposure for 10 d
3 讨论(Discussion)
3.1 OFL和SMX联合暴露10 d对食蚊鱼抗氧化系统的影响
联合毒性往往不是简单的相加作用，在相同种类的抗生素联合作用下可能会产生协同作用，不同种类的抗生素由于不同的作用机制，其联合毒性可能比单一毒性更大。例如，磺胺二甲基嘧啶和诺氟沙星联合暴露，对青鳉胚胎造成了氧化胁迫，但其氧化胁迫方式和途径与单独暴露存在一定差异[25]。OFL和SMX联合暴露10 d，对食蚊鱼抗氧化酶活力和相关基因表达的变化存在剂量-效应关系，在OFL单独暴露锦鲤和SMX单独暴露斑马鱼胚胎时也有这种特征[4-5]。在单独暴露下，2～10 μg·L-1 OFL和0.8～4 μg·L-1 SMX对淡水鲫鱼SOD均无显著影响。在本研究中，0.05～20 μg·L-1 OFL和SMX联合暴露下，食蚊鱼肝脏和肠道组织SOD均出现了显著变化，这提示OFL与SMX之间可能有着复杂的相互作用，其毒性效应比单独暴露更显著。有研究也发现OFL和SMX单独及联合作用，对风车草的生长、生理及微生物群落均有刺激作用，且联合暴露时毒性效应最大[26]。
在OFL和SMX联合暴露10 d后，食蚊鱼在3个浓度处理组中，肝脏组织HSP70基因mRNA表达上调，而肠道组织HSP70基因mRNA表达下调；HSP90基因mRNA表达量在肝脏组织的低、中浓度组表达下调，在肠道组织低、高浓度组表达上调，呈现出组织特异性。同时，在食蚊鱼肝脏和肠道组织中SOD、GST和CAT在低浓度组呈现增长的特征。有研究也发现260 ng·L-1 SMX暴露能增加斑马鱼肠道炎症因子的表达，在低浓度范围诱导鱼体的生理和基因变化[20]。3个组织中SOD酶活力在不同浓度组无抑制现象发生，且在肝脏中浓度组和肠道低浓度组呈现显著增加趋势，同文献报道的结果一致。例如，鲫鱼在50、250和1 250 μg·L-1 OFL暴露7 d内SOD活力显著增加，在100 μg·L-1和500 μg·L-1 SMX暴露7 d内SOD活力也会显著增加[27]；虹鳟鱼暴露于200 μg·L-1卡马西平21 d和42 d后，肝脏SOD活力显著增加[28]。金鱼暴露于0.4 mg·L-1 SMX中7 d，肝脏内SOD活力均显著增加。同时，在肝脏组织中SOD酶活力和CAT酶活力随浓度的变化趋势相同，呈显著正相关(ρ=0.778，P=0.023)，许多研究也表明SOD酶和CAT酶具有协同作用[29]。GST酶在食蚊鱼肝脏和肠道表达量较高，且在OFL和SMX联合暴露10 d后活力升高，与PCPs胁迫禾花鲤后肝脏中的GST酶的变化一致[30]。
肝脏组织中，低浓度组和高浓度组MDA含量显著增加。有研究也发现，虹鳟鱼口服100 mg·kg-1土霉素14 d后MDA含量显著增加[31]。在肠道组织中，3个浓度组MDA含量均呈现显著降低，可能是因为相比于肌肉和肝脏等其他器官，肠道是抗生素的主要吸收区域，对抗生素更加敏感，耐受力较低[32]，受到了破坏性氧化损伤导致MDA含量表达降低。辛伐他汀(SV) 0.5、5、50和500 μg·L-1暴露食蚊鱼实验中，大部分处理组的鱼体MDA含量也都呈现了抑制趋势[33]。
3.2 OFL和SMX联合暴露10 d后食蚊鱼抗氧化酶及基因的相互关系
OFL和SMX抗生素联合暴露10 d后，在食蚊鱼肝脏组织中，CAT酶及CAT基因随浓度增加的变化趋势相同，SOD酶与SOD2基因呈现显著负相关。GST酶与GST基因之间无显著相关，GST基因高浓度组显著上调，而GST酶活力在高浓度组显著下调。在肠道组织中，GST基因低浓度组显著下调，GST酶活力显著上调，GST基因与GST酶活力对浓度的响应相反。在肠道和肌肉组织中，抗氧化酶及其基因无显著相关性，抗氧化系统在蛋白和mRNA表达水平出现毒性响应差异，食蚊鱼抗氧化系统相关基因mRNA的表达对OFL和SMX联合暴露10 d更为灵敏。鱼体暴露于抗生素后，基因响应比酶活力响应更为灵敏，这可能是因为基因翻译为蛋白的过程中受多种调控因素影响[34]，故酶反应滞后于基因的mRNA表达。因此，基因mRNA表达作为生态毒理指标，比酶更具有及时性，能比酶更灵敏和准确地呈现机体的损伤。此外，抗氧化酶及基因在mRNA表达和蛋白水平上有差异，也可能与生物体内酶的多种类型有关，如SOD酶分为有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD，GST酶包括有α、μ、π和θ等亚型。
3.3 OFL和SMX联合暴露10 d与食蚊鱼不同组织中Nrf2、PXR及其调控基因的响应关系
机体在受到氧化胁迫时，会产生ROS促使Nrf2与keap1解离进入细胞核与抗氧化反应原件(antioxidant response element, ARE)结合，进而激活一系列下游抗氧化酶的表达和Ⅱ相解毒酶，以消除ROS对机体的损伤[18]。在3个组织中，Nrf2基因及其下游基因NQO1、GCLC、SOD2和GST的mRNA表达变化，与GST和PXR基因mRNA表达变化相似，呈现随浓度增加先下降再上升的趋势。下游基因与Nrf2、PXR基因相似的剂量-效应关系，反映了Nrf2基因和PXR基因对其下游基因表达的调控。在肝脏组织中，Nrf2基因与NQO1基因呈弱相关，在肠道和肌肉组织中与NQO1和GCLC基因显著相关。PXR基因与GST基因在3个组织中呈现显著正相关，但相关性较低，说明虽然NQO1、GCLC、SOD2和GST基因是Nrf2基因的下游基因，但可能还受其他通路的影响。食蚊鱼在三氯生(TSC)、双氯芬酸(DCF)和辛伐他汀(SV)暴露后，也出现了类似的变化特征[33,35]。在3个组织中，低浓度和高浓度处理组中Nrf2表达与对照组均无显著差异。在中浓度处理组，食蚊鱼肝脏Nrf2基因mRNA表达量显著降低，可能是Nrf2进入细胞核与ARE结合使其减少，进而刺激下游抗氧化酶转录。在中浓度组肌肉组织中，Nrf2基因mRNA表达上调，可能是暴露下产生氧化应激反应，Nrf2与keap1解离速率大于与ARE的结合速率。有研究报道，SMX和氯氰菊酯在环境浓度下能诱导草鱼产生轻度氧化应激反应，且草鱼的生存机制是通过Nrf2及其下游抗氧化基因发挥作用的[36]。综上，环境水平OFL和SMX联合暴露可诱导食蚊鱼产生氧化应激反应，而其抵御外界抗生素氧化胁迫可能与ROS产生激活Nrf2通路有关。
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