新疆地处干旱半干旱地区,干旱少雨,水土流失和风沙侵蚀严重[1],面临着水资源短缺的巨大压力。再生水作为一种稳定可靠的水资源,通过适当的资源化处理[2],可以应用于河道补给、工业生产[3]、农林灌溉[4]、市政杂用和地下水回灌[5-6]等领域。但是由于再生水水质复杂,除了含有的氮和磷等植物所需营养外[7],不同来源的再生水中还含有过量的盐分以及多种重金属等有害物质[8],因此,当再生水用于生态恢复等领域时有必要进行植物种子萌发毒性评估测试。
种子萌发到胚根胚芽生长是植物生命周期中的重要阶段,同时也是最敏感的时期,极易受外界因素的干扰,影响其后期生长发育[9],植物种子萌发试验因具有方法简单、应用方便,种子易获得、高等植物的种子可以在没有营养供应的测试水中生长等优点,应用于水环境毒性评价且备受欢迎[10]。目前国内外广泛关注工业污水[11]、城市生活污水[4]和养殖废水[12]对农作物[13]和草本植物种子[14]萌发及幼苗生长的影响。如吴哈萨[15]研究了矿井水对草坪草生长的影响、廖林仙等[16]研究了城市生活再生水对小白菜生长及产量的影响,Siddiqui和Abbas[10]研究了城市生活再生水对鹰嘴豆种子萌发的影响及毒害作用评价等。但是,目前却没有关注工业再生水对于草坪草和荒漠植物的萌发和生长的影响。
黑麦草和高羊茅为多年生冷季型草坪草,有耐践踏、成坪速度快等诸多优点[17-18]。苏丹草是广泛分布于新疆的一种人工牧草,具有根系发达、抗性较强、适生范围广等特点,也常被用作水土保持和荒滩地治理植物[19]。沙蓬、盐地碱蓬和旱麦草均为干旱区常见荒漠植物,是防风固沙和稳定生态系统的主要植物资源[20]。虽然目前对于采油废水处理后的再生水大部分可进行回注,小部分经处理的采油废水则可外排至收纳水体(《污水综合排放标准》
1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 材料
黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草、盐地碱蓬和沙蓬种子均于2021年购自新疆农业科学院,采买后的种子保存于纸质种子袋中,常温(25～30 ℃)避光储藏待用。试验用油田再生水取自克拉玛依某区人工湿地外排水,再生水水质见表1,清水为试验室去离子水。
表1 试验用油田再生水水质
Table 1 Water quality of reclaimed oilfield water for test
pHSS/(mg·L-1)总盐/(mg·L-1)Total salt/(mg·L-1)BOD/(mg·L-1)COD/(mg·L-1)石油类/(mg·L-1)Petroleum oil/(mg·L-1)As/(μg·L-1)Hg/(μg·L-1)Pb/(μg·L-1)Cd/(μg·L-1)TN/(mg·L-1)TP/(mg·L-1)7.921007 90385.53500.040.250.14<2.5<2.51.54.2
1.2 方法
1.2.1 试验设计
试验共设计6个处理:CK(100%去离子水)、10%(10%油田再生水+90%去离子水)、20%(20%油田再生水+80%去离子水)、30%(30%油田再生水+70%去离子水)、50%(50%油田再生水+50%去离子水)和100%(油田再生水),以上浓度均按照体积比配制。
选取大小均匀、饱满的植物种子,先用75%乙醇表面消毒1 min,随后用30% H2O2溶液浸种10 min以防止真菌/细菌污染[21],最后用去离子水冲洗4次。将处理后的种子均匀放入底部有双层滤纸的培养皿(直径9 cm)内,每皿30粒。将含有10.0 mL各配比的油田再生水溶液置于培养皿中,每个处理重复4次。试验过程中,每天采用称重法保证各处理水分不变。将培养皿放入温度25 ℃/15 ℃(日/夜),光周期16 h/8 h(光/暗)的人工光照培养箱中培养(GXZ型智能培养箱,宁波江南仪器厂,中国)。于培养第2天开始统计发芽数,以胚根伸出作为种子萌发的标志,每天统计1次,种子萌发结束以发芽率基本不再变化为准。试验周期为10 d。
1.2.2 指标测定
萌发指标测定:用计数法每天记录不同油田再生水浓度下的种子萌发数量,持续计数10 d后计算种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数,计算公式如下:
发芽率(GR)=(萌发种子数/供试种子数)×100%
(1)
发芽势(GE)=(发芽高峰时期种子的发芽数/供试种子数)×100%
(2)
发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)
(3)
式中:Dt表示相应的时间(d),Gt表示第t天的发芽率[8];
活力指数(VI)=S×GI
(4)
式中:S为幼苗的生长势,用根长表示[22]。
1.2.3 生长指标测定
胚芽、胚根长度测定:用游标卡尺测量幼苗的胚芽和胚根长度,每个处理随机取10株幼苗(幼苗少于10株的处理,取所有的幼苗),每组3次重复。鲜质量测定:试验进行至第10天时取植物幼苗,每个处理随机取10株(幼苗少于10株的处理取所有幼苗),用滤纸擦干其表面水分后,称其鲜质量,每组3次重复[23]。
1.2.4 耐性评价
(1) 隶属函数分析
对不同油田再生水浓度下6种植物种子的萌发和幼苗生长指标进行综合评价[24],计算发芽期和出苗期5项指标的隶属函数值,将其平均值作为最终评价标准。
(5)
(6)
式中:X为试验不同处理下植物种子某一指标的测定值,Xmax、Xmin分别为测定指标的最大值和最小值。如果某一指标与促进萌发指标呈现负相关,则可以通过反隶属函数计算隶属函数值。将各方法处理下测定的植物种子萌发指标的隶属函数值累加求其平均值,根据平均隶属函数值的大小来确定促进种子萌发的强弱,平均隶属函数值越大,说明促进种子萌发作用越强,反之越弱[25]。
(2) 再生水对植物根系毒性效应评价
通过计算植物根长的生长抑制率[26],运用Origin进行回归模型拟合,将其平均值作为最终评价标准。
抑制率
(7)
式中:RLT为不同处理下植物种子的根长,RLC为空白处理下植物种子的根长。
1.3 数据处理
采用Excel 2016录入数据,SPSS 22.0统计软件对数据进行方差分析,Duncan多重比较,确定无观察效应浓度(NOEC),采用概率回归法分析50%的植物生长变化的受试物浓度(EC50)。浓度-效应曲线通过Origin 2019b Pro软件进行拟合。显著性水平为P<0.05,所有试验数据均以平均值±标准差表示。
2 结果(Results)
2.1 油田再生水对不同植物萌发的影响
由表2可知,随着油田再生水浓度的升高,黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草和盐地碱蓬植物种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均变呈现先增高后降低的趋势。不同配比的油田再生水处理对沙蓬种子的萌发均具有显著的抑制作用(P<0.05),且油田再生水配比越高,对沙蓬种子萌发的抑制作用越明显。与CK相比,100%油田再生水处理下,黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草、盐地碱蓬和沙蓬发芽率分别降低了40.55%、95.67%、57.86%、29%、38.67%和57.33%。
表2 油田再生水对6种植物种子萌发的影响
Table 2 Effect of reclaimed water on seed germination of 6 plants
植物材料Plant material处理Treatment发芽率/%GR/%发芽势/%GE/%发芽指数GI活力指数VI黑麦草Lolium perenneCK86.11±3.61ab55.67±10.26b7.56±0.41c2.65±0.05b10%89.78±1.92a75.67±2.31a9.59±0.38a3.90±0.67a20%82.22±1.92ab54.33±2.31b8.97±0.88ab2.49±0.03b30%79.33±5.09bc36.67±0.58c8.55±0.57b2.28±0.12b50%72.33±3.85c31.00±1.73d7.51±0.30c1.08±0.09c100%45.56±7.70d15.33±4.04e5.77±0.38d0.23±0.03d高羊茅Festuca elataCK95.67±7.51ab65.67±2.31ab8.60±0.93b2.12±0.23b10%100.00±0.00a69.33±3.00a9.95±0.21a2.48±0.08a20%90.00±3.00b54.33±9.24b8.58±0.33b1.93±0.12b30%57.67±5.03c31.33±7.51c4.26±0.95c0.49±0.04c50%52.33±8.08c23.33±6.51c3.53±0.24c0.25±0.15d100%0.00±0.00d0.00±0.00d0.08±0.14d0.00±0.00e苏丹草Sorghum sudanenseCK87.67±4.04ab36.67±11.93b17.87±0.94c2.12±0.23b10%98.00±1.73a52.33±4.04a21.03±0.58a2.48±0.08a20%91.33±7.51ab40.00±7.00b19.77±0.77b2.20±0.12b30%81.00±1.73b35.33±6.81b13.38±0.85d0.49±0.036c50%49.31±3.46c22.11±1.73c8.70±0.42e0.25±0.15d100%28.81±10.15d9.01±1.73d5.25±0.50f0.00±0.00e旱麦草Eremopyrum triticeumCK72.33±4.77c44.33±5.13c15.98±0.55b3.58±0.72c10%88.00±1.73b57.67±4.04b19.45±0.41a4.49±0.35b20%97.67±4.04a76.33±5.77a13.03±0.76c5.12±0.17a30%75.67±2.31c48.33±4.53c12.10±0.47c3.85±0.12c50%63.33±3.00d33.33±3.51d9.37±0.61d1.24±0.28d100%43.33±6.51e23.33±3.51e2.89±0.21e0.37±0.09e盐地碱蓬Suaeda salsaCK82.00±1.73b41.00±8.54ab7.36±0.49a0.93±0.06c10%86.33±1.73ab49.00±4.04a8.26±0.36a1.18±1.37b20%96.31±1.15a52.33±3.46a6.45±0.55b1.64±0.06a30%83.67±1.13b45.67±4.04ab6.06±0.62bc1.07±0.06c50%62.33±4.01c33.33±5.74bc4.83±0.29c0.51±0.02d100%43.33±6.51d23.33±5.74c3.01±0.88d0.41±0.07d沙蓬Agriophyllum squarrosumCK60.33±5.77a32.33±10.79a5.67±0.36a0.39±0.06a10%42.03±1.73b20.00±0.00b3.72±0.38b0.13±0.01b20%41.00±7.32b20.00±0.00b3.71±0.62b0.02±0.00b30%34.68±4.04c18.00±1.73b3.05±0.04c0.02±0.02b50%27.67±4.04d15.67±2.31b1.52±0.13d0.03±1.00b100%3.00±0.00e3.00±0.00c0.42±0.14e0.00±0.00b
注:同列不同小写字母表示不同处理间差异达到显著水平(P<0.05);下同。
Note: Different lowercase letters in the same column in the table indicate significant differences among different treatments (P<0.05); the same below.
与CK处理相比,10%油田再生水处理下,黑麦草、高羊茅和苏丹草种子各萌发指标达到最大值(表2),其发芽率分别为89.78%、100.00%、98.00%;20%油田再生水处理下,旱麦草和盐地碱蓬种子各萌发指标达到最大值,其发芽率分别为97.67%和96.31%。10%及以上油田再生水处理下,沙蓬种子的各萌发指标都显著低于CK处理(P<0.05);30%及以上油田再生水处理下,黑麦草种子和高羊茅种子的各萌发指标都低于CK处理(P<0.05);50%及以上油田再生水处理下,苏丹草、旱麦草和盐地碱蓬种子的各萌发指标都显著低于CK处理(P<0.05)。这表明油田再生水浓度不同,植物种子对其响应也不同。
2.2 油田再生水对植物种子胚芽长、胚根长和鲜质量的影响
由图1可知,随着油田再生水配比的升高,高羊茅、苏丹草和盐地碱蓬植物种子的胚芽长和胚根长呈现先增高后降低的趋势。不同配比的油田再生水处理对沙蓬种子的胚芽长和胚根长具有显著的抑制作用,且油田再生水配比越高,对沙蓬的生长发育抑制作用越明显。与CK相比,100%油田再生水处理下,黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草、盐地碱蓬和沙蓬的胚芽长分别降低了90.41%、100%、77.42%、485.02%、12.15%和100%,胚根长分别降低了51.08%、100%、66.18%、85.34%、37.58%和100%。
图1 油田再生水对6种植物胚芽长和胚根长的影响
Fig. 1 Effect of reclaimed water on seedling height and root length of 6 plants
10%油田再生水处理下,黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草和盐地碱蓬种子的胚芽最长,分别为4.82、2.48、4.00、6.25和1.78 cm;黑麦草、高羊茅、苏丹草和旱麦草种子的胚根长最长,分别为2.07、1.83、1.98和1.74 cm;20%油田再生水处理下,盐地碱蓬种子胚根长最长,为0.99 cm。10%及以上油田再生水处理下,沙蓬的胚芽长和胚根长都显著低于CK处理(P<0.05);20%及以上油田再生水处理下,黑麦草、高羊茅及旱麦草的胚芽长都显著低于CK处理(P<0.05);30%及以上油田再生水处理下,高羊茅和旱麦草的胚根长都显著低于CK处理(P<0.05);50%及以上油田再生水处理下,苏丹草的胚芽长和黑麦草及盐地碱蓬的胚根长都显著低于CK处理(P<0.05)。这表明不同浓度的油田再生水处理对不同种子的胚芽长和胚根长抑制作用不同。
由图2可知,随着油田再生水浓度的升高,黑麦草、苏丹草、旱麦草、盐地碱蓬的鲜质量呈现先增加后减少的趋势,而高羊茅和沙蓬的鲜质量则呈现出降低的趋势。10%油田再生水处理下,沙蓬种子的鲜质量显著低于CK处理,黑麦草、苏丹草和旱麦草鲜质量显著高于CK处理(P<0.05),分别为269.73、541.10和142.66 mg;20%油田再生水处理下,高羊茅种子的鲜质量显著低于CK处理,盐地碱蓬的鲜质量显著高于CK处理(P<0.05),为36.37 mg;50%及以上再生水处理下,黑麦草、高羊茅、苏丹草和盐地碱蓬的鲜质量均显著低于CK处理(P<0.05)。
图2 油田再生水对6种植物鲜质量的影响
Fig. 2 Effect of reclaimed water from oil field on fresh weight of 6 plants
2.3 油田再生水与植物种子萌发和生长指标的相关性分析
如表3所示,运用皮尔逊相关性系数法对再生水浓度和植物萌发及生长指标进行相关性分析,结果表明,再生水浓度与黑麦草、高羊茅、苏丹草和旱麦草的植物萌发及生长指标均呈显著负相关(P<0.01)。再生水浓度与沙蓬和盐地碱蓬的发芽率、胚根长和鲜质量也均呈显著负相关(P<0.01),与胚芽长呈显著负相关(P<0.05)。
表3 油田再生水与植物种子萌发和生长指标的相关性分析
Table 3 Correlation analysis of oilfield reclaimed water and plant seed germination and growth index
黑麦草Lolium perenne高羊茅Festuca elata苏丹草Sorghum sudanense旱麦草Eremopyrum triticeum盐地碱蓬Suaeda salsa沙蓬Agriophyllum squarrosum发芽率GR-0.91**-0.70**-0.93**-0.80**-0.96**-0.96**胚芽长Seedling height-0.92**-0.89**-0.70**-0.91**-0.56*-0.53*胚根长Root length-0.74**-0.91**-0.59**-0.95**-0.79**-0.97**鲜质量Fresh weight-0.85**-0.85**-0.75**-0.67**-0.91**-0.97**
注:**在0.01级别(双尾),*在0.05级别(双尾),相关性显著。
Note: **at level 0.01 (double-tail), *at level 0.05 (double-tail), the correlation is significant.
2.4 植物种子对再生水的耐性评价
不同植物种子萌发对逆境胁迫的反应不同,单一的指标很难准确地评价植物整体抗逆性的强弱[27]。隶属函数评判法应用到植物耐性评价中能够准确地反映植物的抗逆性特征,植物毒性指数也是衡量水毒性的指标之一[28],因此采用隶属函数方法和植物毒性指数对6种植物种子进行了综合耐性评价,挑选出对油田再生水具有更好耐性的植物。
如表4所示,采用隶属函数,综合考量6种植物种子的6项萌发指标指数,得出6种植物种子属函数平均值范围为0.4389～0.4964。6个植物种子的隶属函数平均值分别为0.4869、0.4847、0.4521、0.4482、0.4964和0.4389,由隶属函数值大小排序得出,种子对再生水的耐受性依次为:盐地碱蓬>黑麦草>高羊茅>苏丹草>旱麦草>沙蓬。
表4 6种植物隶属指标
Table 4 The subordinate indexes of 6 plant species
植物材料Plant material发芽率GR发芽势GE发芽指数GI胚根长Root length鲜质量Fresh weight平均值Average排名Sequence黑麦草Lolium perenne0.43020.52400.53410.49430.44670.48692高羊茅Festuca elata0.45000.49670.49470.49690.48640.48473苏丹草Sorghum sudanense0.45540.41810.49720.42230.46740.45214旱麦草Eremopyrum triticeum0.44900.45940.40060.47650.45560.44825盐地碱蓬Suaeda salsa0.45260.52530.44870.58390.47350.49641沙蓬Agriophyllum squarrosum0.44560.48290.48970.37910.39740.43896
由根长计算各个浓度油田再生水对6种植物的生长抑制率,以剂量-效应关系作图(图3),并对结果进行统计分析,得出不同再生水浓度条件下的NOEC和EC50,结果列于表5。
图3 再生水对植物种子根长的剂量-效应关系
Fig. 3 Dose-effect relationship of reclaimed water on the root length of plant seeds
表5 不同再生水浓度下不同植物根长的NOEC和EC50
Table 5 NOEC and EC50 of different plants for root length at different reclaimed water concentrations
植物名称Plant无观察效应浓度(NOEC)No observed effect concentration (NOEC)半数效应浓度(EC50)Concentration for 50% of maximal effect (EC50)R2adj黑麦草Lolium perenne10%32.87%0.8975高羊茅Festuca elata10%33.69%0.8269苏丹草Sorghum sudanense10%30.56%0.9311旱麦草Eremopyrum triticeum10%32.34%0.9380盐地碱蓬Suaeda salsa10%38.23%0.9114
如图3所示,随着油田再生水浓度增大,6种植物种子的根长生长抑制率也逐渐增大。50%以上再生水处理对黑麦草、苏丹草以及盐地碱蓬种子根生长具有明显的抑制毒性;10%以上再生水处理对高羊茅和旱麦草种子根生长具有明显的抑制毒性;而10%～100%浓度的再生水对沙蓬种子的根系生长具有很强的抑制作用。说明沙蓬种子根系萌发受油田再生水毒性敏感,耐受性低。相反由生长抑制率还可得出,在10%的低浓度再生水对除沙蓬种子外地其余植物种子根系生长出现不同程度的促进作用。
NOEC表示再生水没有显著降低植物根长时添加再生水的最高剂量(P>0.05),通过方差分析和邓肯多重比较进行检验。当添加最低剂量再生水时,植物的生长就受到了显著抑制,这种情况下无法测定NOEC[29]。EC50被认为是最精确的毒性效应值,它能反映不同毒物的毒性大小或者不同受体对毒物的耐受性大小[30]。对于沙蓬而言,很低浓度的再生水就可以对其产生抑制毒性,其EC50值为
对其他5种植物而言,较低浓度的再生水就可以对5种植物产生影响,30%及以下油田再生水对其根具有促进影响,30%及以上则对植物根具有不同程度的抑制作用。EC50值大小顺序为:盐地碱蓬(38.23%)>高羊茅(33.69%)>黑麦草(32.87%)>旱麦草(32.34%)(表5)。
3 讨论(Discussion)
目前研究者广泛认为工业污水、城市生活污水和养殖污水含有大量的营养物质可用于农作物种植和草本植物灌溉,但其对植物种子萌发的毒性作用也逐渐受到人们的重视。有研究表明,未经稀释的工业污水对农作物的萌发和生长均有一定的抑制作用,而稀释后的工业污水则可以促进农作物种子和草本植物的萌发和生长,起到一定的肥料作用,适合用于灌溉[31-35]。城市生活污水根据不同的处理方式,对农作物和草本植物的影响也不同,有研究者认为稀释后的城市生活污水对农作物和草坪草的萌发和生长起到促进作用[36-37],而朱敏和隋燕[4]的研究表明,稀释和未稀释的城市生活污水均对草坪草有抑制作用。本研究则表明,油田再生水浓度的增加与6种植物种子的发芽率、胚芽长、胚根长和鲜质量均呈显著负相关,油田再生水在30%及以下处理时,对黑麦草、高羊茅、苏丹草、旱麦草和盐地碱蓬的萌发和幼苗生长均有促进作用,未经稀释的油田再生水则对其均有不同程度的抑制作用,这可能是由于未经稀释的油田再生水中有较高浓度的重金属、石油烃和盐离子[36],其共同作用抑制了种子萌发和幼苗生长,而水中的有些重金属,例如镉、铅等在低浓度对植物生长有一定的促进作用,因而适当稀释油田再生水后,减少了油田再生水的毒性,降低了重金属[38]、石油烃和盐离子浓度,从而促进了植物的生长。不同的植物种子对油田再生水的耐受性不同,对于沙蓬而言,稀释过的油田再生水依旧显著抑制了其萌发和生长,因而沙蓬不适宜用油田再生水进行灌溉。
利用隶属函数来评价水中污染物对植物的毒性和植物对外来胁迫的耐受性并采用剂量-效应曲线对植物的毒性效应进行量化,进一步确定了盐地碱蓬对油田再生水更具有耐受性,这可能是由于盐地碱蓬本身为一种盐生植物,对高浓度的盐离子具有一定的耐性[39]。10%～100%浓度的再生水对沙蓬种子的根系生长具有很强的抑制作用。一定的高浓度范围内再生水处理对其余植物种子根生长具有明显的抑制毒性;而低浓度范围表现为促进作用,在用油田再生水进行灌溉时需要考虑植被物种和再生水混合比例。因而,油田再生水应用于荒漠植被修复、绿化以及牧业生产等领域具有广大的潜力,今后应在探寻最优的油田再生水适配比例以及开展与传统施肥生态效应的比较研究,为干旱区油田再生水资源化利用提供新的解决方案,而且也为国家建立再生水资源环境利用相关标准提供参考依据。
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