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自厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，Anammox)工艺诞生以来，凭借其经济、高效与可持续性而成为生物脱氮领域一大研究热点，并被公认为是时下最具有工程应用前景的新型生物脱氮工艺。然而受制于厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonia oxidant，AnAOB)的生长速率较慢，世代周期较长等因素[1]，导致厌氧氨氧化菌富集难，反应器启动慢，加上运行不稳定等问题较长，影响了厌氧氨氧化工艺规模化工程应用。此外AnAOB对pH、O2等生长环境因素极为敏感，易受到干扰物质的抑制。因此，学者们围绕厌氧氨氧化反应器的启动及稳定运行开展了相关研究[2]。
近些年来，研究发现Anammox中包含了大量以血红素和硫铁蛋白形式存在的细胞铁，并且铁元素也作为重要的辅助因子参与厌氧氨氧化脱氮的过程中[3]。袁欣眀等[4]利用Fe(Ⅲ)促进血红素的合成强化了Anammox工艺，任立峰等[5]利用铁元素历时84 d成功启动Anammox工艺。铁元素的存在会促进厌氧氨氧化菌的生长[6]，而不同形态和价态的铁离子促进作用也不同。与其他形式的单质铁相比纳米零价铁 (nano zero valent iron，nZVI)具有更大的比表面积，更强的还原性，能够快速消耗溶解氧，从而降低氧化还原电位，有利于维持厌氧氨氧化需要的厌氧环境[7]。有研究表明，合适的nZVI投加有利于提高厌氧氨氧化微生物活性[8]。nZVI腐蚀产生的铁离子(Fe(II)/Fe(III)是包括在厌氧氨氧化酶分解代谢中起关键作用的细胞色素c蛋白、肼合酶和肼脱氢酶等血红素酶的重要成分[9]。
由于nZVI易氧化、团聚，难以液相中均匀分布，研究者提出碳基质-nZVI复合材料，有利于nZVI分散和腐蚀[10]，使其在生物反应器体系中更好地与微生物接触。同时碳基质-nZVI可使Fe(0)与碳紧密接触，产生原电池反应，在反应器中产生微电流促进氧化还原反应，吸附沉淀等反应，有利于污染物去除，被应用于Anammox脱氮研究中[11]。
生物炭(biochar，BC)来源广泛，价格低廉，多为农林废弃物经加工产生的富碳、多孔的固体物质，并能长期停留在环境介质中[12]，可通过物理吸附、离子交换等多种机制降解污染物，此外，适量的BC还能改善AnAOB性能，加速Anammox工艺的启动[13]。但单一的生物炭材料物理化学性能稳定，不能满足复杂污染物的处理。因此，目前有研究人员对纳米零价铁进行改性，将纳米零价铁负载在比表面积大、官能团丰富、孔隙率高和稳定性好的生物炭上，构建微电解体系，充分发挥两者的优势。但现有的研究通常将两种材料按照一定比例充分混合，仍存在铁碳负载不均匀的局限性。
基于以上研究现状，本研究改进负载方法，利用液相还原法将nZVI充分分散于生物炭孔隙表面，对所制备材料的表面形貌和结构进行了表征。并在EGSB反应器中，探究在BC-nZVI诱导下Anammox工艺的快速启动、长期运行特性，以及氮转化规律，研究不同pH条件下复合材料对厌氧氨氧化体系中氮元素转化的影响，分析微生物群落结构的变化特征，探索了BC-nZVI对厌氧氨氧化工艺的启动的影响，为Anammox工艺的工程应用提供理论支持和技术参数。
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实验采用EGSB反应器，装置如图1所示。该反应器由有机玻璃组成，内径7 cm，高57.6 cm，反应器有效反应体积为2.2 L，通过水浴维持运行温度在(30±1) ℃。
反应器连续运行90 d，BC-nZVI投加量固定为30 mg·L−1，实验分为3个阶段，通过改变进水浓度和水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)，不断提升负荷，具体运行工况如下表1所示。
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接种污泥取自于城市污水厂厌氧池活性污泥，初始反应器内MLVSS为4.9 g·L−1。采用的人工配水，以氯化铵和亚硝酸钠为原料，根据实验需要配置相应浓度，NaHCO3用做调节碱度剂和无机碳源，维持进水pH在7.0~7.5，配水中投加微生物生长所需要的微量元素[14]。
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利用pH计测定pH和温度。分别采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法、纳氏试剂分光光度法、紫外分光光度法测定NO2−-N、NO3−-N和NH4+-N的浓度。
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以水稻秸秆为原材料，在马弗炉350 ℃下热解3 h得到原始生物炭(BC)。取2 g BC与8.8 g FeCl3·7H2O按照Fe与BC质量比1:1配制成悬浮溶液，并超声1 h，形成BC颗粒分散均匀的FeCl3-BC负载体系。将100 mL 80 g·L−1的NaBH4溶液以1滴·s−1的速度滴加到上述FeCl3负载体系中，并不断地搅拌，直至将铁离子完全还原为Fe(0)。用去离子水和无水乙醇反复洗涤，在N2气体的保护下干燥,得到BC-nZVI。将制备所得材料通过扫描电镜-能量色谱法(SEM-EDS)[15]、表面衍射分析以及比表面积测定等方法对材料进行表面结构分析。
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为探究在不同pH条件下BC-nZVI对厌氧氨氧化的影响，设计批次实验，考察厌氧氨氧化脱氮效能。取第3阶段反应器内混合泥样，初始NO2−-N和NH4+-N质量浓度分别为50 mg·L−1和30 mg·L−1，用1 mol·L−1的盐酸调节进水初始pH分别至5、6、7。使用纯度为99%的氮气，曝气15 min后加入BC-nZVI，在摇床内以30 ℃，160 r·min−1的条件反应，每隔1 h取3个水样，用0.45 μm滤膜过滤后，测量水样中NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N的浓度，并取3次水样的平均值作为单次有效数据。
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微生物分析分别取接种污泥和反应器运行第55 天的污泥作为样品分别标记为R0，R1。采用Illumina MiSeq 测序平台对样品中的微生物进行高通量测序分析，包括DNA提取、PCR扩增、MiSeq 文库构建和MiSeq 测序。16S rRNA基因在V3~V4的高变区测序，选用细菌通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)及806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。在优化序列的基础上按照97%相似性分析，得到每个OTU对应的物种分类信息，并在各个水平上统计每个样品的群落组成，获得样品中微生物门(phylum)和属(genus)等物种组成及丰度。
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1) BC-nZVI形貌分析。图2(a)为生物炭载体的SEM图，图2(b)和图2(c)为负载纳米铁后的生物炭的SEM图。制备的nZVI粒径在100~500 nm，并已成功负载在生物炭表面。负载在生物炭上的球形链状体为纳米铁，与相关文献中制备的纳米颗粒材料呈球形链状相似[16-17]。
2) BC-nZVI的表面结构分析。通过X射线衍射对BC-nZVI表面进行分析。如图3所示，在2θ=44.8°为纳米铁的衍射峰，在2θ=24.8°处为BC的特征峰。这说明通过液相还原法制备的BC-nZVI复合材料同时具有铁单质和碳元素。而在35°处的吸收峰为Fe2O3和Fe3O4。造成这种现象的原因可能是材料在测试阶段与空气接触产生不同程度的氧化，以至于材料表面形成氧化壳。值得注意的是，谱图中并没有其他杂峰，说明得到的产品纯度较高。
3)比表面积分析。负载纳米零价铁后，生物炭比表面积由37.52 m2·g−1降至21.29 m2·g−1。这主要是由于在合成nZVI的过程中，nZVI充分进入到生物炭深层的多孔结构中，从而使负载后的BC比表面积小于负载前的比表面积[18]。此外，结合图2(b)可知，由于nZVI附着于生物炭表面，可避免nZVI团聚并沉积于污泥中。
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Anammox启动过程中氮的转化结果如图4所示。反应器启动运行初期(0~5 d)，总氮去除率仅在10%左右，NH4+-N质量浓度基本无变化，反应器内溶解氧高达0.83 mg·L−1，无厌氧氨氧化脱氮发生。反应器内的微生物为了抵抗不良生境，出现部分细胞自溶，释放出内源有机物[19]。反硝化菌可以利用菌体自溶产生的有机物发生反硝化作用。该阶段总氮损失主要是由于反硝化作用和微生物增殖利用所致。
在第6 天以30 mg·L−1投加BC-nZVI，反应24 h后，总氮快速下降，去除率接近60%，NO2−-N快速消耗，出水中未能检出NO2−-N，而NH4+-N浓度并没有明显降低。造成NO2−-N和硝态氮降低的原因可能有2点：其一是在非生物作用下，nZVI释放出Fe2+，Fe2+可以将亚硝酸盐还原为NO和N2O[20-21]，同时，nZVI和硝酸盐发生化学反应生成NH4+-N[22]；其二是在微生物作用下，以零价铁或二价铁、内源有机碳作为电子供体，将硝酸盐或亚硝酸盐还原为N2[23-24]。综上分析，推测反应器内的氮素转换是多反应(Feammox，NDFO，IC-ME和Anammox)共同参与(图5)，相关反应如式(1)~式(4)所示。此外nZVI会消耗水中的溶解氧生成Fe2+和Fe3+，有利于形成厌氧氨氧化菌生长的厌氧环境[25]。投加BC-nZVI 3 d后，NO2−-N无明显去除。当第14 天再次投加BC-nZVI时，总氮去除率达到75%，出水NO2−-N和NO3−-N浓度迅速降低，同时NH4+-N浓度也逐渐下降。在约第20 天时，NO2−-N和NH4+-N的利用比约为1:1，NO3−-N生成量与NH4+-N的消耗量之比为0.3。除非生物反应外，NH4+-N的去除可能由Feammox和Anammox共同贡献所致，因为Feammox常伴随着Anammox反应发生，说明AnAOB丰度也在逐渐上升，此时的NH4+-N应为Feammox与Anammox同时利用，该结果与ERDIM研究结果一致[26]。综上所述，第1阶段氮的转化是生物反应和非生物反应共同作用的结果。此外，由于生物炭对于氮素去除的贡献度较低，对硝酸盐几乎没有吸附作用，因此，第1阶段氮素下降大部分为nZVI参与的非生物反应。反应器运行到第43 天时，NO2−-N与NH4+-N消耗比接近理论值(1:1.32)，NO2−-N与NH4+-N的去除率达到99%，此时反应器内Anammox反应占据主导，说明反应器已成功启动厌氧氨氧化反应。
在运行阶段Ⅱ、Ⅲ，进水NH4+-N和NO2−-N控制在1﹕1.3左右，不断提高进水基质，反应器运行至第58 天，调整HRT为13 h，NO2−-N和NH4+-N的去除率依然稳定在98%以上，总氮平均去除率和去除负荷分别为86%和0.43 kg·(m3·d)−1，说明此时该系统已具有较稳定的厌氧氨氧化性能。相较于nZVI，改性的BC-nZVI中铁和生物炭可以起到协同作用， BC可提供电子强化硝酸盐的还原，同时为微生物提供大量附着位点，有利于基质传递给AnAOB，从而加速Anammox的启动。
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为了研究投加BC-nZVI对Anammox系统的影响，在系统稳定运行阶段第34天和第82天分别投加30 mg·L−1 BC-nZVI。如图6所示，在投加BC-nZVI初期，Rs(NO2−-N消耗量与NH4+-N消耗量之比)和Rp(NO3−-N生成量与NH4+-N消耗量之比)严重偏离理论值，Rs高达2.75，显著高于理论值1.32，此时Rp值显著低于厌氧氨氧化反应的理论值(0.26)。Fe(Ⅱ)会导致部分NO2−-N和NO3−-N还原为氨氮，因此认为，Rp会随着Fe(Ⅱ)的增多而降低[27]。综上分析，推测反应器内的氮素转换是多反应(Feammox，NDFO，IC-ME和Anammox)协调作用所致。如图6所示，每次投加BC-nZVI后3 d内，Rs与Rp均会显著偏离理论值，这可能是由于系统内发生IC-ME反应，大量NO3−-N被还原为NH4+-N，之后NH4+-N被铁氨氧化菌利用，同时伴随着Fe(Ⅱ)的产生，而Fe(Ⅱ)浓度的提升促进NDFO反应。之后，Rs和Rp趋于稳定，可能零价铁在体系内被钝化，表面形成了Fe2O3等壳层，原电池反应难以进行。铁离子浓度趋于稳定。
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表2为投加不同价态与形态的铁元素对Anammox的启动及微生物富集的影响对比。由表2可知，nZVI确实有利于加快Anammox的启动，在氮负荷相近时，投加nZVI的反应器启动时间相对较短。在本研究在EGSB反应器投加BC-nZVI，历经43 d左右成功启动了Anammox，总氮去除率达到80%以上。在相同负荷条件下，BC-nZVI投加量仅为30 mg·L−1，远低于文献研究，表明nZVI负载于BC中，铁炭充分接触，有利于nZVI分散于生物炭表面，促进铁炭微电解的电子转移和生物厌氧氨氧化。
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合适的pH是微生物发挥高效性能的重要运行条件。图7为pH对厌氧氨氧化脱氮性能的影响。尽管反应时间7 h左右，不同pH下的总氮去除率均在75%左右。但pH影响反应速率， pH为7时进水的反应速率低于较低的pH。在不同的pH条件下，前2 h内, NO2−-N与NH4+-N浓度缓慢下降，而出水pH快速上升。造成这种现象的原因可能是BC-nZVI原电池反应可消耗混合液中的H+产生Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)。反应第2 h，NO2−-N与NH4+-N浓度快速下降。在pH=5和pH=6的批次实验中，在第4 h NO2−-N几乎完全被消耗，总氮去除率达到70%。值得注意的是，在pH=7时，反应进行到第4 h，总氮去除率仅达45%。此外，在不同pH下，投加BC-nZVI后， NH4+-N均出现先升后降的趋势，在pH=6时，相比pH=5、pH=7，NH4+-N峰值在第3 h提前出现。这说明在pH=6时BC-nZVI能够较早参与IC-ME反应。而在整个反应过程中均未检测出NO3−-N 。有研究[32]表明，液相中pH的降低会加快铁的腐蚀，导致大量铁离子析出且参与反应，从而提高NO3−-N的还原效率。
厌氧氨氧化反应会产生碱度，IC-ME反应的存在也会增加pH。有研究[33]表明，厌氧氨氧化污泥系统的最适pH为7~8，BC-nZVI的投加有利于提高系统对进水pH的适应性，XIE等研究也证实厌氧氨氧化混合系统将扩大最适pH范围[34-35]。
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1)微生物多样性分析。通常，Chaol和ACE指数表示物种丰度，Shannon和Simpson指数表示物种多样性[36]，Simpson指数随着物种多样性的增加而降低，而Chaol和ACE指数随着微生物丰富度的增加而增加。微生物群落的多样性特征结果如表3所示。Shannon指数与Simpson指数的变化，表明投加BC-nZVI的厌氧氨氧化过程性能提升过程中，微生物多样性增加。
2)微生物群落结构。由图8可知，污泥样品中浮霉菌门(Planctomycetota)、变形菌门(Proteobaxteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)、酸杆菌门(Acidobacteria)作为优势菌门。在第55 天污泥样品中，包含AnAOB的浮霉菌门[37](Planctomycetota)、变形菌门(Proteobaxteria)，其丰度分别由2.11%和17.15%升至25.61%和22.70%。其中酸杆菌门属于典型的Feammox系统参与到氮循环过程中。变形菌门包含氮循环功能相关的亚硝酸盐氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌等，其在促进微生物生长与微生物群落调节中发挥着重要作用[38]，在微生物门水平上可支持BC-nZVI强化Anammox系统脱氮效能。图8反映了微生物在属水平上群落结构特征。启动成功后作为Anammox菌属的unclassified_Brocadiaceae，相对丰度由接种污泥的0.3%增加到22.3%，成为绝对的优势功能菌，从微生物的角度证实EGSB反应器中脱氮性能的提升主要是由厌氧氨氧化贡献。内源反硝化菌属Comamonadaceae的丰度由0.01%上升为0.6%，此外，有研究表明，Anammox细菌Brocadiaceae可能具有与Feammox相关的厌氧氨氧化潜力[39]，这一微生物特征与反应器脱氮特征相吻合。此外，绿弯菌门Chloroflexi 中norank_f_norank_o_SBR1031、norank_f_Anaerolineaceae菌和Bacteroidetes_vadinHA17菌是主要的微生物厌氧消化种群[40-41]，在接种污泥中相对丰度较高，在成熟的厌氧氨氧化污泥体系中相对丰度分别由5.1%、9.7%、5.7%下降到4.2%、4.1%、0.07%。
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1)采用液相还原法制备BC-nZVI复合材料，在生物炭表面负载的nZVI为链状球形颗粒，粒径为100~500 nm，比表面积为21.29 m2·g−1。材料纯度较高，主要为单质铁和碳元素，表面形成Fe2O3和Fe3O4的氧化层。
2)以城市污水厂厌氧池活性污泥作为接种污泥，投加质量浓度为30 mg·L−1 的BC-nZVI，43 d即可成功启动厌氧氨氧化，总氮去除负荷和去除率稳定在0.22 kg·d−1和80%以上。BC-nZVI投加后3 d左右，氮的转化以铁元素参与的物化反应占主导，随后以Anammox生化脱氮为主。
3) BC-nZVI的投加，可以为AnAOB提供大量附着位点，促进厌氧氨氧污泥颗粒化，且不同价态的铁离子会被细胞利用合成铁硫蛋白和血红素有利于促进厌氧氨氧化工艺的启动。BC-nZVI提高了厌氧氨氧化系统对进水pH的适应性。
4)在BC-nZVI强化的成熟污泥体系中，浮霉菌门(Planctomycetota)和变形菌门(Proteobaxteria)占主导，其丰度可占48%左右。 Unclassified_Brocadiaceae作为AnAOB优势菌属，相对丰度达22.3%，成为绝对的优势功能菌。
BC-nZVI诱导厌氧氨氧化工艺的快速启动及运行特性
Rapid start-up and the operation characteristics of Anammox process induced by BC-nZVI
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摘要: 厌氧氨氧化工艺的启动周期和稳定性已成为工程化应用的制约因素，铁元素可促进厌氧氨氧化菌的生长，BC-nZVI诱导下厌氧氨氧化工艺的启动与长期稳定运行特性是值得研究的课题。为此，采用液相还原法制备BC-nZVI复合材料，成功将粒径100~500 nm的nZVI负载于生物炭表面。在膨胀颗粒污泥床(expanded granular sludge bed，EGSB)中，BC-nZVI的投加大幅缩短了Anammox工艺的启动时间，提高了氮负荷冲击性能以及在弱酸性环境下的适应能力。通过投加30 mg·L−1 BC-nZVI，仅需43 d即可快速启动Anammox工艺，总氮去除负荷和去除率稳定在0.22 kg·d−1和80%以上。在BC-nZVI强化成熟的污泥体系中，浮霉菌门(Planctomycetota)和变形菌门(Proteobaxteria)占主导，其中 unclassified-Brocadiaceae作为AnAOB优势菌属相对丰度达22.3%，成为绝对的优势功能菌。Abstract: The start-up period and stability of the Anammox process have become the limiting factors of its engineering applications. Iron can promote the growth of Anammox bacteria. The start-up and long-term stable operation characteristics of the Anammox process induced by BC-nZVI are the topics worthy of study. In this study, BC-nZVI composites were prepared by a liquid-phase reduction method, and nZVI with particle size of 100-500 nm was successfully loaded on the surface of biochar. In EGSB(Expanded Granular Sludge Bed), the addition of BC-nZVI significantly shortened the start-up time of the Anammox process, and improved the resistance to the nitrogen shock loads, as well as the adaptability in weakly acidic environments. By adding 30 mg·L−1 BC-nZVI, the Anammox process could be quickly started only after 43 days, and the total nitrogen removal load and removal rate were stable at 0.22 kgTN·d−1 and above 80%, respectively. In the mature sludge system enhanced by BC-nZVI, Planctomycetota and Proteobaxteria dominated. Of them, unclassified_Brocadiaceae. as the dominant AnAOB genus, had a relative abundance of 22.3%, becoming the absolute dominant functional bacteria.
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Key words:
- EGSB /
- Anammox /
- Feammox /
- fast start-up /
- nano zero-valent iron(nZVI) /
- nitrogen removal efficiency.
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图 2 BC-nZVI的电镜扫描图(SEM)及外观图
Figure 2. Scanning electron microscope (SEM) images and appearance of BC-nZVI
图 5 在BC-nZVI作用下Anammox的脱氮路径图
Figure 5. Denitrification pathway diagram of Anammox under BC-nZVI
图 7 不同pH下混合系统氮素去除速率的变化
Figure 7. Changes in nitrogen removal rate of the mixed system under different pH
图 8 R0和R1污泥系统门水平和属水平微生物群落结构
Figure 8. Microbial community structure of R0 and R1 sludge systems at phylum and genus levels
表 1 反应器运行工况
Table 1. Operating conditions of the reactor
运行阶段 时间/d 进水氨氮质量浓度/
(mg·L−1)进水亚硝质量浓度/
(mg·L−1)HRT/h 氮负荷/
(kg·d−1)阶段Ⅰ 1~30 50 66 26 0.11 阶段Ⅱ 30~60 100 132 26 0.22 阶段Ⅲ 60~90 100 132 13 0.42 
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表 3 微生物物种多样性指数
Table 3. Microbial species diversity index
样品 物种丰度 群落多样性 覆盖率/% ACE指数 Chaol指数 Shannon指数 Simpson指数 R0 1 182 1 168 5.32 0.01 99.81 R1 1 172 1 161 4.75 0.05 99.63
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