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制药废水水质成分复杂，往往同时含有较高浓度的有机物(COD可达4 450~32 500 mg·L−1[1])、无机盐等，属于难处理的高浓度工业废水。据估计，全世界产生的制药废水中约有一半未经特殊处理就被排放[2]，其中mg·L−1水平的高质量浓度药物活性化合物会造成严重水污染[3]，是对环境健康的巨大威胁。我国在2008年就已经制定了各类制药废水的排放标准，目前处理方法主要包括物理化学和生物处理技术，实际工程中往往需将二者结合提高处理效能[4-5]。其中，以厌氧消化为代表的生物处理技术不但可以有效去除废水中的污染物，还能同时将有机物转化为甲烷等资源，具有污泥产量低、降本增效的优点，因此是实现制药废水减量化、无害化和资源化的重要技术路径[6-7]。然而，制药废水中含有大量的生物毒性物质，对微生物具有毒害作用，严重影响了活性微生物的正常功能。特别是我国每年会产生近2000万吨含有磺胺类抗生素的制药废水，而磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole, SMX)是使用最广泛的磺胺类抗生素之一[8]，其会在叶酸代谢周期中充当竞争性抑制剂，干扰对氨基苯甲酸的产生，对微生物细胞产生毒性作用，减缓脂肪酸氧化细菌繁殖[9]，导致VFAs的积累，使厌氧系统逐步丧失功能[10]。因此，如何控制高浓度SMX制药废水的毒性，强化厌氧微生物的群落和功能的稳定性至关重要。
粉末活性炭(powdered activated carbon, PAC)是强化高浓度有机废水厌氧消化处理的重要策略。PAC作为一种典型多孔物质，具有理想的比表面积[11]，其丰富发达的内部孔道一方面可以有效地吸附废水中的有机物和杂质，提高难降解废水的可生化性[12]；另一方面，还可以为厌氧微生物提供附着生长的物理介质，辅助厌氧微生物的生长繁殖，提高厌氧消化反应器内微生物的数量[13-14]。更重要的是，PAC作为良好的电子导体，附着在其表面的厌氧微生物可以借助其降低电子转移的内阻，诱导VFAs氧化细菌和产甲烷菌的种间直接电子传递(direct interspecies electron transfer, DIET)来强化产甲烷过程，提高厌氧消化效率[15]。由此可见，PAC有望实现生物毒性控制、微生物增殖和活化协同，提高厌氧消化处理有毒有机废水的稳定性，为生物毒性突出的制药废水的厌氧消化处置提供可能。多项研究表明，PAC的添加一方面可以缓解挥发性脂肪酸累积、氨氮浓度过高对厌氧消化的不利影响[16]，另一方面也有助于提升厌氧消化去除COD、浊度、胶体和抗生素的能力[17]。然而，PAC是否可以在高浓度SMX存在的情况下缓解厌氧消化抑制、维持厌氧消化期间微生物群落的稳定还有待确定。基于此，本研究通过在厌氧消化过程中引入PAC作为流动电子传递体，探讨添加PAC对暴露于高浓度SMX废水厌氧消化的影响。重点研究对比了PAC、SMX对产甲烷效率和VFAs利用率的影响，并且研究了添加PAC的反应器中功能微生物的特性和厌氧代谢活性。
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接种污泥来自北京市高碑店污水处理厂热水解后厌氧消化池的污泥。采用1 mm孔径的滤网过滤，从而去除大颗粒物后进行预培养。配水模拟山东省某制药公司高浓度SMX废水[18]，由乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、NH4Cl和KH2PO4根据C:N:P = 100:5:1的组成配置，其中SMX质量浓度为100 mg·L−1。SMX质量浓度的选定一方面是因为现有的研究提出SMX达到40 mg·L−1以上时可能会抑制厌氧消化的效率[19]，另一方面也是模拟了上述制药废水中的质量浓度(2.5~155 mg·L−1)。此外，加入2 mL的微量元素溶液[20]，微量元素溶液中含有30 mg·L−1 MgSO4、50 mg·L−1 MnSO4·7H2O、100 mg·L−1 NaCl、15 mg·L−1 FeSO4·7H2O、1 mg·L−1 FeCl3·3H2O、20 mg·L−1 CaCl2·2H2O、1 mg·L−1 CoCl2·6H2O、0.5 mg·L−1 ZnCl2、0.5 mg·L−1 CuCl2、100 mg·L−1 H3BO3、0.5 mg·L−1 AlCl3、0.2 mg·L−1 (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.5 mg·L−1 NiCl2·2H2O、0.2 mg·L−1 Na2WO4·2H2O和0.2 mg·L−1 KI，每升配水中加入2 mL上述微量元素溶液。用HCl和NaOH溶液将pH调节至6.8。所选用的活性炭粒径为47-80 μm，比表面积为853.42 m2·g−1，使用去离子水冲洗3次，在60 °C的烘箱中干燥至恒重，加入到厌氧反应器中。
该实验使用全自动甲烷潜力测试系统(AMPTS® II，Bioprocess Control AB，瑞典)进行，本测试系统由中温厌氧消化单元、CO2吸收单元和甲烷体积记录单元组成[21]，可以实时监测甲烷产量，其他指标需取样检测，在本文1.2中。每个反应器含有200 mL接种物和200 mL底物的混合物，每瓶的混合液悬浮固体浓度(MLSS)为28.03 g·L−1，混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)为9.98 g·L−1，COD约为28 000 mg·L−1。PAC投加量参考相关研究[22-23]，1 g·g−1(以COD计)以下的投加量对厌氧消化的强化效果较差，当投加量达到25 g·g−1时，甲烷产量相较于8 g·g−1差别不大，故在研究中选择了4 g·g−1和8 g·g−1 PAC。批量厌氧生化甲烷潜力测试(biochemical methane potential, BMP)的实验条件主要分为4类：1)作为对照的未加干预的厌氧消化；2)分别添加4 g·g−1和8 g·g−1粉末活性炭(PAC)的厌氧消化；3)添加SMX的厌氧消化；4)同时添加PAC与SMX的厌氧消化(4 g·g−1 PAC-SMX和8 g·g−1 PAC-SMX)。每组实验1式2份，水浴温度控制在(37±2) ℃，设置150 r·min−1间歇搅拌，5 min搅拌和5 min静止交替进行。
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甲烷产量由配备气体流量计的AMPTS II自动测量。对每个反应器进行取样，其中MLSS和MLVSS按照标准方法测定[23]，用pH计(H198103, HANNA, Italy)测量pH。然后通过0.45 μm滤膜过滤污泥样品，再进行进一步分析。SCOD使用哈希消解器(DRB 200，哈希，美国)和紫外分光光度计(DR 3 900，哈希，美国)测定。通过气相色谱仪(FID+FPD)(2010Plus，日本岛津)和Agilent DB-FFAP 123-
3232 色谱柱(30 m, 0.32 mm, 25 μm)检测VFAs的质量浓度[24]。实验结束后，用购自上海酶联生物技术有限公司的ELISA试剂盒测定ATP、细胞色素C(cytochrome c, Cyt C)和辅酶F420。 -
实验结束时，从各组反应器中收集污泥样品，并在-80 °C下保存，用于DNA提取和进一步分析。根据E.Z.N.A.® soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA，美国)说明书进行微生物群落总DNA提取。细菌使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V4-V5可变区进行PCR扩增。古菌采用524F10extF(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958RmodR(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)对16S rRNA基因V4-V5可变区进行PCR扩增[25]。使用ABI GeneAmp®PCR热循环仪(ABI, CA, USA)扩增。Illumina Miseq-PE300测序服务由上海美吉生物医药科技有限公司提供。
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利用修正的Gompertz模型(式(1))拟合实验观测的CH4累积曲线[26]。VFAs的变化与一级动力学拟合方程如式(2)[22]所示。
式中：Gt是实际累计甲烷产量，mL·g−1(以VS计)；Gm是最大甲烷产量，mL·g−1(以VS计)；Rm是每日最大甲烷产率，mL·(g·d)−1(以VS计)；e=2.718 3；λ是滞后期，d。进行非线性回归分析以估计动力学常数(λ和Rm)的值。根据BMP测得的甲烷产量，使用初始估计值来获得数据的最佳拟合模型。
式中：C0、Ct为特定底物的初始质量浓度和时刻t的质量浓度 (mg·L−1) ，k是对应的一阶动力学常数 (h−1) 。对六组实验的微生物群落结构进行主成分分析(principal component analysis, PCA)[27]，并使用Canoco 5进行了冗余分析(redundancy analysis, RDA)[28]。
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如图1所示，通过测定不同反应器的累积甲烷产生曲线可以发现：对照组在启动初期便产生了甲烷，滞后并不明显，这与底物中存在的易于生物利用的乙酸盐有关[29]。PAC的加入进一步提升了初期的甲烷快速生成，说明PAC能够促进参与厌氧消化的微生物的活性[30]。相比之下，SMX的引入显著降低了甲烷的初期产量，体系的厌氧消化进程呈现出明显的滞后效应。经过13 d的反应，对照组的累积甲烷产量为248.56 mL·g−1；而添加了4 g·g−1 PAC和8 g·g−1 PAC的2组反应器中的累计甲烷产量在第13天时分别达到了279.40 mL·g−1和279.82 mL·g−1，分别比对照组提高了12.4%和12.5%，这说明PAC的引入能够促进厌氧消化的快速发生，提高厌氧消化的电子利用效率。
相反地，添加SMX的反应器甲烷产量下降至216.95 mL·g−1，相比对照组低了13%，说明SMX对于厌氧消化过程产生了明显的抑制效果。通过加入PAC，SMX对厌氧消化过程的抑制效果得到了逆转。如图1所示，PAC的投加量分别为4 g·g−1和8 g·g−1时，甲烷产量相比对照组分别提高了6.2%和9.4%。由此可见，引入的PAC可能减少了SMX对微生物的干扰，从而强化了厌氧消化过程的发生[13]。
修正的Gompertz模型良好的拟合了各实验组的累计甲烷产量，明确了PAC、SMX等物质共存条件下厌氧消化体系的动力学参数(表1)。一方面，在添加PAC的反应器中，拟合最大甲烷产率和最大甲烷产量均高于对照组，且PAC 8 g·g−1的滞后期(λ=1.64 d)相对于对照组(λ=2.87 d)缩短了43%，每日最大甲烷产率也由对照组的36.74 mL·(g·d)−1提升至38.58 mL·(g·d)−1(4·g·g−1 PAC)和37.95 mL·(g·d)−1(8·g·g−1 PAC)。相反，SMX组的滞后期(λ=3.86 d)与对照组相比延长了34%，每日最大甲烷产率也下降至31.26 mL·(g·d)−1。PAC的引入成功改善了SMX造成的滞后效应：4·g·g−1 PAC -SMX(λ=2.82 d)和8·g·g−1 PAC -SMX的滞后期(λ=2.93 d)与对照组非常接近；与此同时，PAC有效提升了SMX暴露下的每日最大甲烷产率：4 g·g−1和8 g·g−1的PAC-SMX组分别可以将Rm提高至38.39 mL·(g·d)−1和43.53 mL·(g·d)−1，高于对照组的同时也几乎与4 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC的体系一致。因此，从动力学上看，SMX对甲烷生成具有明显的抑制作用，而PAC可以逆转SMX的抑制作用，提高甲烷生成速率和产量。
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pH、SCOD、VFAs是厌氧消化过程中的重要理化指标，反映和决定了厌氧消化过程的代谢状态和性能[31]。在产甲烷过程中，乙酸、甲酸等小分子有机物会转化为甲烷、二氧化碳，这个过程消耗了有机酸，导致pH升高。如图2(a)所示，各反应器的pH由初始时的6.6逐步提升。SMX的加入导致初期pH上升速率相比对照组明显减慢，直到第4~5天才快速上升。这充分对应了图2(b)中所示SMX在第4~5天才显著下降至40 mg·L−1的结果，对于厌氧体系的干扰能力明显下降。相比之下，得益于加入PAC的吸附和微生物的同步降解，SMX在体系内的质量浓度在第2~3天便下降至40 mg·L−1的水平；对应地，加入PAC的所有组在初始阶段pH都快速上升；说明PAC可以显著降低SMX对于厌氧消化过程的影响[32]。
如图2(c)所示，在第1天中，对照组中的SCOD(29 215 mg·L−1)高于所有PAC组(28 215~28 369 mg·L−1)。这是因为PAC能够有效吸附可溶性有机物，这些有机物也可以作为附着其表面的产甲烷菌的碳源，促进产甲烷菌的生长和代谢，可以更快消耗量底物中的VFAs。最终，在对照组、SMX、4 g·g−1 PAC、4 g·g−1 PAC-SMX、8 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC-SMX中，后续的SCOD的消耗比例分别为89.4%、89.7%、95.8%、92.6%、94.7%和94.1%。即使存在SMX，PAC的加入也可以促进微生物对VFAs的利用，提高其最终的利用比例。因此，PAC能够促进微生物对可溶性有机物的消耗，有利于提高微生物群落的活性。
通过测定不同实验组对于VFAs底物的利用速率可以发现：SMX的存在会抑制厌氧消化中乙酸盐和丙酸盐的代谢，动力学常数(k)相比于对照组分别降低了15.8%和47.6%(图2(d)、(e)，表2)。丙酸的利用速率降低可能是由于SMX对产酸细菌叶酸代谢过程的干扰，而叶酸是微生物生长和DNA合成中的重要物质，叶酸代谢的抑制可能会对产酸细菌的代谢活性产生不利影响[33-34]，而乙酸利用显著衰减则归因于SMX对产甲烷菌活性抑制的结果[35]。直到第4~5天，乙酸盐和丙酸盐的利用速率才显著加快，这对应于SMX的质量浓度降低至~40 mg·L−1(图2(b))。而单纯添加PAC有效改善了乙酸盐和丙酸盐的利用，其动力学常数k相比对照组最多可分别提升15.4%和46.5%。即使在SMX存在的体系下投加PAC也可以有效阻止SMX的抑制效应，8 g·g−1 PAC -SMX组对乙酸盐和丙酸盐的动力学常数k相较SMX组可分别提升40.8%和190.9%，且均高于对照组。这是由于PAC作为流动电子传递体，提高了产酸细菌的电子供给与产甲烷菌的电子接受效率，从而提升了对乙酸盐和丙酸盐的利用效率。相比而言，SMX对丁酸盐的利用并无明显抑制(如图2(f))，这是由于丁酸盐的生物可利用性相比乙酸和丙酸盐较弱，微生物在厌氧消化初期会优先利用乙酸和丙酸盐[36-37]；所以相比于对照组，无论是否加入SMX，丁酸盐的利用速率无明显差异。然而，添加PAC进一步增强了丁酸盐的利用，8 g·g−1 PAC的k相较对照组提升了51.8%，8 g·g−1 PAC-SMX的k相较SMX组提升了59.2%，且高于对照组。结合之前的结果(图2(c))可以证明，通过添加PAC，PAC表面可以同时富集有机物(包括丁酸盐分子)和附着厌氧消化细菌(如丙/丁酸盐氧化细菌和产甲烷八叠球菌)[38]，借助种间直接电子传递作用，可以构建电活性微生物与产甲烷菌之间的联系，进而加速VFAs的利用和提高甲烷的产率。
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VFAs利用速率的提升与厌氧代谢活性密切相关，ATP为能量储存和运输物质，而Cyt C和辅酶F420在能量转换过程中也扮演着重要角色[39]。作为氧化还原介质的PAC[30]促进了细胞的ATP合成，为厌氧代谢提供更多的能量[40]。如图3(a)所示，对照组、SMX、4 g·g−1 PAC、 4 g·g−1 PAC-SMX、8 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC-SMX 6个反应器中的ATP浓度分别为43.8、39.7、49.2、47.2、52.3和 53.9 nmol·L−1。这一结果表明PAC增强了古菌和细菌的能量产生和代谢活性。PAC可以通过促进细胞外呼吸使底物更彻底的氧化，使微生物通过氧化磷酸化产生 ATP。在此过程中电子沿呼吸链转移，添加PAC可与微生物形成较高的电位差，促进质子动力的形成并产生ATP[41]。另外，质子跨膜的速度直接影响电子转移的速度，因此，ATP含量可以反映电子传递的效率，这也是PAC组底物利用效率更高的重要原因。
一方面，ATP的增加为Cyt C等蛋白质合成提供了必要的能量，这有助于提高PAC系统中Cyt C对于DIET的形成效率, Cyt C传递过程本身也可参与分解代谢，产生ATP[42]。Cyt C通过改变卟啉环中铁原子的价态，可实现电子在电子供体和受体之间的可逆转移。在厌氧呼吸中，Cyt C 主要负责将电子从复合体Ⅲ传递给复合体Ⅳ，参与厌氧呼吸中电子的传递过程[43-45]。为了完成细胞外呼吸作用，需要更多的位于细胞外质和外膜的Cyt C数量。因此，如图3(b)所示，对照组SMX、4 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC、4 g·g−1 PAC-SMX、8 g·g−1 PAC -SMX6个反应器中的Cyt C的浓度分别为34.3、34.5、41.4、38.4、34.4和39.1nmol·L−1。
另一方面，ATP 含量的增加可以促进氢营养型产甲烷过程中的电子传递(F420H2/F420转换)，加快电子的跨膜传输和CO2的还原。鉴于辅酶F420是产甲烷菌的独特酶，参与低氧化还原电位下甲烷产生的细胞内电子转移，辅酶F420浓度在厌氧消化系统中，通常用于反映产甲烷菌的活性[46]。因此，测定了污泥中辅酶F420的含量(图3(c))，对照组、SMX、4 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC、4 g·g−1 PAC-SMX、8 g·g−1 PAC-SMX的含量分别为60.0、54.3、70.8、71.7、67.8、72.4 U·L−1。4组含PAC的反应器中辅酶F420的浓度有所增加，与这4组中最大甲烷产量的增加是一致的，同时也表明电子传递得到了加强。这表明添加PAC的反应器中的甲烷菌可能直接接受来自产酸菌的e−和H+，使辅酶F420向还原态F420H2转化，参与将CHO-H4MPT还原为CH3-H4MPT，以驱动后续反应中甲烷的生成[47]。另外，PAC作为载体可以促进产甲烷菌生物膜的形成，从而进一步保护产甲烷菌免受SMX的抑制，使得PAC-SMX组的产甲烷菌活性更高。
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本实验多样性的分析是按照使用100%的序列相似度作为阈值来定义引物扩增序列变体(amplicon sequence variant，即ASV，其是一种在16S rRNA等特定基因区域进行高通量测序时使用的序列变体定义方法)。由表3可以看出，各组反应器污泥中古菌与细菌的覆盖率(coverage)均达到99.8%以上，说明此次样品ASV归类较为合理，可真实反映反应器中微生物群落结构情况。环境微生物群落的丰富度和多样性可以通过单样本的多样性(Alpha多样性)反映，其中群落丰富度(community richness)指数主要包括Ace指数和Chao 1指数，群落多样性(community diversity)指数包括Shannon指数和Simpson指数[48]。其中，对于细菌而言，由于SMX的添加，SMX组和PAC-SMX组的群落多样性和丰富度均有不同程度的下降，尤其以SMX组的下降最为明显，而PAC的添加改善了SMX对细菌丰富度的负面影响。这一现象在古菌也有类似的发现，在暴露于SMX的组别中，古菌的多样性随着PAC的投加而改善。这些结果表明，PAC的添加可有效改善SMX对于群落构成的负面影响。
如图4所示，对各组反应器古菌群落结构在属水平上进行分析，主要属为产Methanosarcina、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanomassiliicoccus，其中，SMX组的Methanosarcina的丰度(52.59%)显著低于其他组，而所有添加PAC的反应器Methanosarcina的丰度均高于对照组(73.59%~92.56%)。Methanosarcina是一种多功能产甲烷菌，具有乙酸型、氢型和甲基型产甲烷菌的能力，是已知代谢途径最多的产甲烷古菌属，可以利用多种底物产生甲烷，包括乙酸、甲醇、甲胺和H2/CO2，可以有效地提高微生物的适应性和稳定性[49-50]。Methanosarcina是仅有的两个能够使用乙酸盐产生甲烷的属之一[51-52]，其丰度的提升与乙酸盐降解速率的变化一致，是PAC系统中有效提高产甲烷的关键古菌。
细菌的种群群落结构如图5所示，Firmicutes (厚壁菌门)、Synergistota (互养菌门)、Proteobacteria (变形菌门)和Caldatribacteriota (钙热微菌门)为主要细菌。其中Firmicutes在PAC组富集增强，表明具有加速有机物降解能力的细菌在PAC的添加下得到了选择性富集[53]。在4组添加PAC的反应器中，主要菌属为Clostridia D8A-2 (梭状芽胞杆菌属)、Syntrophobacter (互营杆菌属)、Syntrophomonas (互营单胞菌属)和Candidatus_Caldatribacterium (念珠菌)。Clostridia D8A-2是VFAs产甲烷降解的潜在同养细菌[54]，在4种添加PAC的反应器中的丰度为15.3%~29.2%，而在对照组和SMX组分别为11.7%和3.5%。Syntrophobacter和Syntrophomonas在添加PAC组定向富集，这2个菌属分别在丙酸以及丁酸的互营养代谢中起到重要作用，对丙酸丁酸的利用以及厌氧消化过程的进行有利。PAC可直接干预Syntrophomonas等和Methanosarcina间直接电子传递过程，其中，Methanosarcina可通过上调的Cyt C更快地接受来自Syntrophomonas等的电子来还原CO2并产生CH4，实现在SMX的抑制下稳定提高PAC系统中产甲烷效率[55-56]。另外，在四种添加PAC的反应器中丰度达到7.1%~15.6%的Candidatus_Caldatribacterium可能参与具有电子转移潜力的乙酸盐的同养氧化[56]。另外，添加PAC的反应器与SMX降解相关的norank_f_norank_o_SBR1031和Bacillus的丰度均有提高，这与PAC-SMX组中SMX降解速率的提升相一致[57-58]。综上所述，PAC的添加为富集与VFAs和SMX降解相关的优势属创造了理想的条件，物种间的直接电子转移可能是促进SMX废水中有机物厌氧消化的重要原因。
通过PCA分析组间微生物群落的差异(图6(a))，可以看出群落结构的差异分为PAC体系(4 g·g−1 PAC、8 g·g−1 PAC、4 g·g−1 PAC-SMX、8 g·g−1 PAC-SMX)、SMX体系(SMX组)和PAC、SMX均未添加体系(对照组)3种类型。这一结果揭示了PAC和SMX的引入对微生物群落结构发生明显改变。RDA分析体现了初始条件与主要微生物群落的相关性(图6(b))，PAC投加量与Methanosarcina、Clostridia D8A-2、Syntrophobacter、Syntrophomonas、Candidatus_Caldatribacterium、norank_f_norank_o_SBR1031和Bacillus呈正相关，表明PAC对DIET相关菌属的富集和SMX降解相关菌属具有正向调控作用；SMX对Syntrophobacter、Syntrophomonas 和Methanosarcina等呈负相关，与Methanobacterium、Thiopseudomonas、norank_f_norank_o_SBR1031和Methanomassiliicoccus等呈正相关，表明SMX可能会抑制脂肪酸氧化细菌和Methanosarcina的代谢活性，且SMX和PAC的添加均会诱导SMX降解菌属的富集。因此，暴露于SMX的厌氧消化系统受到PAC的调节，有助于提高COD去除率和产甲烷性能，提高VFAs利用效率，促进厌氧消化性能的快速恢复(图7)。
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本研究探讨了PAC在减缓高浓度SMX暴露于厌氧消化系统引发的产甲烷抑制方面的应用，提升了SMX废水的处理效率和微生物群落的稳定性，得到主要结论如下。
1)高浓度SMX会降低甲烷产率并延长滞后期。然而，当PAC被引入到系统中时，可以减轻SMX对甲烷产率的抑制效应，且滞后期缩短了29.97%~35.02%。这是因为PAC的添加可以快速降低SMX在污泥中的有效浓度，从而减少了其对产甲烷微生物的抑制作用，改善了甲烷的生成。
2) PAC可以对厌氧代谢活性产生正向调控。在SMX废水中添加PAC使 ATP含量增加了18.89%-35.78%,为有机物分解提供了能量支持。ATP的增加一方面为Cyt C等蛋白质合成提供了必要的能量，这有助于提高PAC系统中Cyt C对于DIET的形成效率，另一个方面，促进了氢营养型产甲烷过程中的电子传递(F420H2/F420转换)，加快电子的跨膜传输和CO2的还原，进而提升了甲烷产量。
3) PAC对VFAs氧化细菌(如Syntrophobacter和Syntrophomonas等)和种间直接电子传递相关产甲烷菌(Methanosarcina)具有显著的富集作用。Methanosarcina可通过上调的Cyt C更快地接受来自Syntrophomonas等的电子来还原CO2并产生CH4，可以实现在SMX抑制下稳定提高系统的VFAs利用和产甲烷效率。
PAC促进直接电子传递强化厌氧消化处理SMX废水的机制
Mechanism of enhanced anaerobic digestion by PAC promoting direct electron transfer for SMX wastewater treatment
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摘要: 抗生素会显著抑制厌氧消化，探究简便易行的促进种间电子转移的方法，对于优化养殖、制药等废水的处理与资源化具有重要意义。本文考察了粉末活性炭(powdered activated carbon, PAC)强化厌氧消化处理高浓度磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMX)废水的效能与机制。高浓度SMX抑制了厌氧消化，使得最大甲烷产量降低13%，而向厌氧污泥中添加4 g·g−1(以COD计)或8 g·g−1 PAC均抵消了这种不利影响，相较于SMX暴露控制组提升了22.4%，显著改善了甲烷生成。PAC会对厌氧代谢活性产生正向调控，丰富了污泥中ATP、Cyt C和辅酶F420这些在能量转换过程中的重要物质，还丰富了潜在的种间直接电子转移(DIET)菌群和SMX降解相关的优势属。PAC会强化挥发性脂肪酸(Volatile Fatty Acids,VFAs)氧化细菌(Syntrophobacter和Syntrophomonas等)和产甲烷菌(Methanosarcina)的DIET过程，促进VFAs转化为甲烷。Abstract: Antibiotics significantly inhibit anaerobic digestion, and it is important to optimize the treatment and resource recovery of pharmaceutical wastewater by exploring simple and easy methods for promoting interspecies electron transfer. Herein, the efficacy and mechanism of powdered activated carbon (PAC)-enhanced anaerobic digestion for the treatment of high-concentration sulfamethoxazole (SMX) wastewater were investigated. SMX with high concentration hindered anaerobic digestion, resulting in a 13% reduction in maximum methane production. The addition of either 4 g·g−1(as COD) or 8 g·g−1 PAC to the anaerobic digested sludge could avoid the inhibition and significantly improve methanogenesis by 22.4% compared to the SMX-exposed control group. In addition, PAC boosted anaerobic metabolic activity, enriching sludge with ATP, Cyt C, and coenzyme F420, which were important energy storage and transport substances for microorganisms, as well as direct interspecies electron transfer (DIET) flora and dominant genera associated with SMX degradation. PAC could strengthen the DIET between the oxidizing bacteria in VFAs (Syntrophobacter and Syntrophomonas, etc.) and methanogenic bacteria (Methanosarcina), facilitating the conversion of VFAs to methane.
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图 1 对照、SMX和PAC–SMX反应器的累积甲烷产量变化
Figure 1. Cumulative methane production in control, SMX, and PAC–SMX systems
图 2 各组反应器的pH变化及磺胺甲恶唑、SCOD和挥发性脂肪酸的质量浓度变化Fig. 2 Changes in pH and mass concentrations of sulfamethoxazole, SCOD and volatile fatty acids in each group of reactors
图 3 各组反应器的厌氧代谢活性指标的变化
Figure 3. Changes in anaerobic metabolic activity indices in each group of reactors
图 7 PAC促进DIET强化厌氧消化处理SMX废水的机理图
Figure 7. Mechanism diagram of PAC promoting DIET-enhanced anaerobic digestion of SMX wastewater
图 4 古菌微生物群落分析
Figure 4. Microbial community analysis of archaea at the genus level in the sludge
表 1 使用修正的Gompertz模型估计的动力学参数
Table 1. Kinetic parameters estimated using the modified Gompertz model
名称 Gm/
(mL·g−1)Rm/
(mL·(g·d)−1)λ/d R2 Gt/
(mL·g−1)对照组 259.53 36.74 2.87 0.995 3 248.56 SMX 262.94 31.26 3.86 0.995 2 240.48 4 g·g−1 PAC 294.53 38.58 2.68 0.994 6 279.4 8 g·g−1 PAC 297.06 37.95 1.64 0.981 0 279.8 4 g·g−1 PAC-SMX 278.28 38.39 2.82 0.992 2 263.88 8 g·g−1 PAC-SMX 282.68 43.53 2.93 0.991 2 272.04 
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表 2 表 2 挥发性脂肪酸利用速率的一级动力学拟合
Table 2. Table 2 First-order kinetics of volatile fatty acids degradation
名称 乙酸 丙酸 丁酸 k/h−1 R2 k/h−1 R2 k/h−1 R2 对照组 0.006 77 0.948 0.007 96 0.982 0.007 39 0.971 SMX 0.005 02 0.919 0.004 17 0.978 0.007 48 0.970 4 g·g−1 PAC 0.007 27 0.954 0.010 41 0.990 0.010 12 0.989 8 g·g−1 PAC 0.007 81 0.929 0.011 66 0.978 0.011 22 0.971 4 g·g−1 PAC-SMX 0.006 35 0.974 0.010 29 0.972 0.010 11 0.968 8 g·g−1 PAC-SMX 0.007 07 0.950 0.012 13 0.967 0.011 91 0.962
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表 3 细菌和古菌的微生物群落多样性分析
Table 3. Analysis of microbial community diversity in bacteria and archaea
菌种 反应器 ACE Chao1 Shannon Simpson 覆盖率/% 古菌 对照组 20.33 20.00 0.65 0.72 99.99 SMX 20.00 20.00 0.49 0.79 100.00 4 g·g−1 PAC 21.00 21.00 0.75 0.68 100.00 8 g·g−1 PAC 26.00 26.00 0.87 0.59 100.00 4 g·g−1 PAC-SMX 20.00 19.33 0.34 0.86 99.99% 8 g·g−1 PAC-SMX 20.00 20.00 0.63 0.74 100.00 细菌 对照组 848.02 828.75 4.53 0.03 99.80 SMX 508 508 4.12 0.05 100.00 4 g·g−1 PAC 782.54 764.4 3.85 0.09 99.70 8 g·g−1 PAC 699.37 689.5 4.43 0.04 99.90 4 g·g−1 PAC-SMX 658.79 643.27 3.65 0.11 99.80 8 g·g−1 PAC-SMX 639.55 632.06 4.02 0.04 99.90
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