实验用化粪池底泥取自于天津市河北工业大学某学生公寓化粪池内，原泥的相关性指标：pH 7.3±0.25，上清液SCOD值为（672.10±170.50）mg·L⁻¹，氨氮为（212.89±20.55）mg·L⁻¹，多糖为（28.88±4.30）mg·L⁻¹，蛋白质为（111.52±18.22）mg·L⁻¹。实验所用氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）及纳氏试剂等均为分析纯，酶制剂选用中性蛋白酶、α-淀粉酶以及脂肪酶，具体性质见表1。

在250 mL的烧杯中加入60 mL底泥样品，90 mL去离子水，放置于六联搅拌器（MY3000-6B，武汉梅宇）中以200 r·min⁻¹的速率搅拌反应，依次进行复配酶投加量（0%~15%（w/w）、反应时间（0~6 h）、温度（5~65 ℃）及pH（5~10）4个批次的影响因素实验。

反应完成后，取一定量样品置于台式多功能离心机（VELOCITY 18R，Dynamica公司）中以4 000 r·min⁻¹的速率离心15 min，并取其上清液使用0.45 µm的微孔滤膜抽滤，测定上清液中SCOD、多糖、氨氮以及蛋白质4项指标，并在最优条件下对底泥及上清液进行SEM、颗粒粒径、EPS及三维荧光光谱分析，探讨复配酶水解化粪池底泥的机理。

SCOD采用快速消解分光光度法测定；多糖采用苯酚-硫酸法测定；氨氮采用纳氏分光光度法进行测定；蛋白质含量选用Lowry-Folin法测定；EPS采用热提取法测定；EPS中各层有机物质变化采用三维荧光扫描光谱仪（G9800A，美国安捷伦科技有限公司）检测；颗粒粒径采用激光粒度分析仪（Mastersizer 2000，马尔文仪器有限公司）进行分析；反应前后的底泥样品经电热鼓风干燥箱（101-00BS，上海力辰邦西仪器有限公司）烘干后，采用扫描电镜分析仪（7610F，日本电子株式会社）进行分析。

由于生活污水中通常含有大量碳水化合物、蛋白质、脂肪等物质，这些物质会沉积在化粪池底泥中，使得单一类型的生物酶往往难以有效的水解化粪池底泥。因此本实验选择中性蛋白酶、α-淀粉酶及脂肪酶3种酶复配的形式水解化粪池底泥，探究其最佳配比。实验在pH 7、温度25 ℃、反应时间2 h，复配酶投加量为2%（W/W）的条件下，研究了中性蛋白酶∶α-淀粉酶∶脂肪酶3者配比分别为1∶1∶1、2∶1∶1、3∶1∶1、4∶1∶1、1∶2∶1、1∶3∶1、1∶4∶1、1∶1∶2、1∶1∶3、1∶1∶4时对化粪池底泥水解效果的影响，并与空白组（原泥，0∶0∶0）进行对比，分析不同配比对化粪池底泥上清液SCOD、多糖、氨氮和蛋白质的含量变化，结果见图1。

由图1可知，投加复配酶后，上清液中的SCOD、多糖、氨氮与蛋白质的含量均较原污泥大幅度提高，表明化粪池底泥中的有机质在3种酶的联合作用下被水解，释放出大量溶解性有机质和氨氮等，使得液相中SCOD、多糖、氨氮等浓度升高。其中，中性蛋白酶能将大分子蛋白质分解成氨基酸^[9]；α-淀粉酶主要作用于底泥中的淀粉类物质，可催化水解淀粉中的α-1,4糖苷键，将其分解为α-极限糊精、寡糖和葡萄糖等小分子物质^[10]；脂肪酶是一类催化脂肪（甘油三酯）水解的酶，主要作用是将脂肪分解为甘油和脂肪酸^[11]。

图1结果表明，随着中性蛋白酶占比的增加，液相中SCOD、多糖、氨氮及蛋白质含量增加；随着α-淀粉酶用量的增多，多糖含量稍有增加，蛋白质含量基本不变，SCOD和氨氮呈现先减少后增加，整体变化不大的趋势；而随着脂肪酶用量的增加，SCOD、多糖和蛋白质稍有降低，氨氮先降低后升高，总体呈降低趋势。该结果表明，化粪池底泥中蛋白类物质含量较多，碳水化合物含量次之，脂肪类物质含量较少，该结果与文献报道一致^[12-13]。在中性蛋白酶∶α-淀粉酶∶脂肪酶配比为4∶1∶1时底泥水解效果最优，SCOD、多糖、氨氮、蛋白质浓度与原泥相比，分别增加了1 999.90、733.98、35.90和156.94 mg·L⁻¹。3种酶的最佳配比值可能与化粪池底泥构成中此3类物质的含量占比有关。综上所述，后续实验使用的复配酶配比为：中性蛋白酶∶α-淀粉酶∶脂肪酶=4∶1∶1。

在中性蛋白酶∶α-淀粉酶∶脂肪酶配比为4∶1∶1、pH 7、温度25 ℃、反应时间2 h的条件下，研究了复配酶投加量（0%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%和15%（w/w））对化粪池底泥水解效果的影响，如图2所示。

由图2(a)、(b)可知，当复配酶投加量从0%（w/w）增加到3%（w/w）时，SCOD与多糖分别从672.10 和28.88 mg·L⁻¹增加到2 328.00和1 210.93 mg·L⁻¹；当复配酶投加量为5%~15%（w/w）时，SCOD和多糖增加较为迅速，投加量为15%（w/w）时，两者分别达到最高值9 712.50、5 623.55 mg·L⁻¹。但从整体上看，SCOD与多糖均随复配酶投加量的增加呈现线性增加。根据酶促反应动力学可知，当底物浓度足够高时，酶的活性位点会被足够数量的底物分子占据，在这种情况下，反应速率会随着酶浓度的增加而提高。因为更多的酶分子可以同时催化底物转化为产物，即水解效果随着随酶浓度的增加快速上升，并与酶浓度成线性关系，表现为一级反应。

由图2(c)、(d)可知，在0%~5%（w/w）范围内，氨氮和蛋白质的含量随着复配酶投加量的增加从212.89和189.82 mg·L⁻¹缓慢升高到272.60和331.58 mg·L⁻¹；而当投加量大于5%（w/w）时，氨氮和蛋白质的浓度开始迅速升高，且在15%（w/w）投加量时达到最高值360.67和709.02 mg·L⁻¹。这可能是由于，在中性蛋白酶的催化下，污泥中所含的蛋白质类有机物溶出、部分微生物细胞膜结构溶解，细胞内及EPS中的蛋白质释放到污泥上清液中^[14]，同时释放的蛋白质会被进一步分解为氨基酸，导致上清液中蛋白质和氨氮的浓度增加^[15]。但由于初始投加量较小，水解不充分，因此氨氮和蛋白质的变化趋势不明显。经过复配酶预处理后，蛋白质含量的升高，一方面是因为底泥细胞的溶解过程中使固态蛋白质转变为了可溶性的蛋白质；另一方面，生物酶本身包含一定量的蛋白质，这也是蛋白质含量升高的一个因素。此外，根据以上实验结果可知，随着蛋白酶绝对用量的增加，COD、氨氮等物质大量溶出，进一步证实了化粪池底泥中蛋白类物质含量较多。

综上可知，复配酶水解化粪池底泥的效果随投加量的增加而增强，其中当投加量从5%（w/w）增加到8%（w/w）时，各指标增量较为突出，SCOD、多糖、氨氮和蛋白质含量分别为5 492.50、3 054.40、305.56和460.77 mg·L⁻¹，结合经济性考虑，最终选择8%（w/w）为复配酶最佳投加量。

在pH 7，复配酶投加量8%（w/w），温度25 ℃条件下，研究了反应时间对化粪池底泥水解效果的影响，结果如图3所示。由图3可知，上清液中SCOD、多糖、氨氮和蛋白质4者含量变化的趋势基本一致，皆是随着反应时间的延长呈先升高后降低的趋势，且均在反应时间2 h达到最大，4者的含量分别从初始的672.10、28.88、254.37、111.52 mg·L⁻¹增加到7 542.50、3 380.24、351.36、571.05 mg·L⁻¹。这是由于反应初期复配酶活性较高，酶解作用可以破坏底泥中的碳水化合物、蛋白质、脂肪等有机物，以及微生物絮体结构，增强底泥的增溶作用，随着底泥絮体的裂解，先前被保护免受酶攻击的有机大分子有机物质及微生物细胞等暴露出来，进而被复配酶水解，使得SCOD、多糖等可溶性有机物的含量随着水解时间的延长快速增长，并在反应2 h时达到最大值。此后，随着反应时间的延长，酶活性开始降低，也存在着酶活性中心被底泥中有机质分子占据或者吸附作用导致酶反应活性的降低的情况^[16]，有机物的溶出速率降低，且此时底泥中部分细菌的代谢速率高于酶促水解速率，因而导致溶解性物质浓度逐渐下降^[17]。因此，选择2 h作为最优反应时间进行后续实验。

在复配酶投加量为8%（w/w）、pH 7、反应时间2 h的条件下，研究了不同温度（5、10、15、25、35、45、55、65 ℃）对化粪池底泥水解效果的影响，如图4所示。由图4可知，SCOD、多糖及蛋白质3者含量变化均随温度的升高而呈现出持续上升的趋势，在65 ℃时均达到最高值，此时上清液中SCOD、多糖和蛋白质分别为10 412.50、5 482.78和1 555.13 mg·L⁻¹。一方面由于温度对生物酶活性具有较大的影响，大多数酶在低温环境下催化反应的速度较慢，随着反应温度的升高，酶促反应速率迅速升高，水解效能逐渐增强；另一方面，试验所用中性蛋白酶和脂肪酶的最佳温度范围小于55 ℃，α-淀粉酶的最佳温度小于70 ℃，当反应温度超过上述最佳温度时，酶则会出现失活的现象^[18]，严重影响酶的催化速率。但由于低温热水解（T<100 ℃）^[19]的作用同样会引起污泥絮体的解体以及细胞膜中化学键的破坏，导致EPS和细胞内有机物（包括蛋白质、多糖和脂质）溶解并释放到污泥上清液中^[20]，因此导致3者含量持续上升。而图4(c)结果显示，氨氮含量随着温度的升高呈先升高后降低的趋势，这可能是因为当温度过高时氨氮在水中的溶解度会有一定程度下降（即随水分蒸发转移到气相中）导致的^[21]。

考虑到在传统化粪池中额外设计加热装置则会增加运行成本和能耗，同时图4结果显示复配酶在常温条件（25 ℃）下也能表现出较好的水解效能（SCOD、多糖、氨氮和蛋白质分别为5 253.10、2 878.52、239.38和524.65 mg·L⁻¹）。因此，选用25 ℃进行后续实验。

在复配酶投加量为8%（w/w），温度25 ℃，反应时间2 h的条件下，研究了pH在5~10范围内对化粪池底泥水解效果的影响，如图5所示。由图5可知，SCOD、多糖及蛋白质含量的变化趋势相同，在pH 5~10范围内，随着pH的增高，SCOD、多糖及蛋白质3者含量均呈先稍微下降后逐渐缓慢升高的趋势。其中，在pH 6~8范围时，3者变化不大。由于中性蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的适宜pH分别6~7、6~7和7~9，因此pH 6~8时大致处于复配酶的适宜范围，复配酶水解能力较强，此时SCOD、多糖、蛋白质的整体变化范围均在5 597.50~5 967.50、2 887.74~2 993.28、420.91~513.38 mg·L⁻¹之间。当pH继续增加时，尽管部分生物酶失活，复配酶水解能力下降，但在偏碱性条件下（pH 10），底泥中微生物细胞壁的磷脂双分子层较容易被破坏，导致更多的胞内聚合物（如可溶性蛋白质、多糖和脂类）被释放^[22]，从而导致3者含量依旧保持上升的趋势。相比之下，偏酸性环境同样会抑制生物酶活性，但酸性环境会分解链间氢键，使污泥结构膨胀破裂，促进底泥微生物细胞破裂和溶解，而过程相对缓慢^[23]。因此，在pH 6~8范围内，复配酶对化粪池底泥的水解效果影响不大。

图5(c)结果显示，氨氮含量随着pH值的升高呈逐渐降低趋势。这是由于pH较低时（pH 5），化粪池底泥在酶解和酸解的催化作用下发生部分溶解，部分蛋白类物质和微生物细胞被溶出进入上清液中，同时溶出的蛋白类物质可被进一步水解为多肽、二肽和氨基酸，氨基酸进一步通过脱氨基作用转化为低分子易生物降解的有机酸、氨氮及CO₂，使得上清液中氨氮浓度升高^[24]。由于氨氮在水中的存在形态与pH值密切相关，随着pH值的升高，氨氮逐渐由离子态转变为自由态氨，并容易从液相中释出进入气相，从而导致氨氮浓度随着pH值的升高逐渐降低^[25]。

考虑到，中性蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶在偏酸、碱性条件下会失活，且化粪池底泥的pH通常在7~8左右，因此反应过程中不对底泥进行pH调节。

使用扫描电子显微镜对复配酶处理化粪池底泥前后污泥的表面结构进行分析，结果见图6。从图6可以看出，原泥表面大部分区域较为平整，致密（图6(a)），而经复配酶（图6(b)）处理后，底泥表面结构明显变得松散，凹凸不平，孔隙结构较多。这是因为复配酶处理时会破坏底泥中有机质以及微生物细胞结构，使污泥絮体颗粒变得更细，具有更大比表面积和更发达的孔隙结构^[26]，内部物质溶出并转移到液相之中，使得胶体状的大颗粒底泥被转化成了分散、悬浮状的小污泥颗粒群^[27]。

多糖和蛋白质是底泥微生物EPS的主要组成成分，为进一步分析复配酶对化粪池底泥的水解效果，研究了在不同复配酶投加量条件下底泥微生物EPS组分及含量的变化，如图7所示。由图7(a)可知，随着复配酶投加量的增加，上清液S-EPS（溶解型EPS）、LB-EPS（松散结合型EPS）和TB-EPS（紧密结合型EPS）中的多糖与蛋白质的含量均随之逐步增加，其中多糖增加的趋势较为明显。当投加量为1%（w/w）时，各层EPS中多糖加蛋白质的总含量由大到小为：S-EPS>TB-EPS>LB-EPS；此后，随着投加量的增加，复配酶对化粪池底泥产生水解作用逐渐增强，各层EPS均呈增长趋势，EPS各层变化趋势变为S-EPS>LB-EPS>TB-EPS。其中，S-EPS增长幅度最大，在投加量单位15%（w/w）时，S-EPS含量达到6 669.00 mg·L⁻¹。这是由于TB-EPS是胞外聚合物的最内层^[28]，经酶解处理的底泥释放的溶解性有机质由TB-EPS逐步转移到LB-EPS，最后到S-EPS中，因而使得S-EPS中多糖及蛋白质的增量较为明显。

不同复配酶投加量下EPS总含量变化情况如图7(b)所示。原泥的EPS为453.92 mg·L⁻¹，随着复配酶投加量的增加，EPS总量逐步增加，且各层EPS均有明显增多。在投加量为15%（w/w）时，S-EPS、LB-EPS、TB-EPS分别由原始的149.34、83.44、221.15 mg·L⁻¹增加到6 669.00、1 593.48和988.15 mg·L⁻¹。图7结果显示，在复配酶作用下，化粪池底泥中有机物以及微生物EPS的水解效果较为明显，生物酶处理后更多物质释放到液相中，导致各层EPS均随着投加量增加而增多。

荧光物质是污水中溶解性有机物（DOM）的重要组成部分之一，可采用3D-EEM进行DOM中所含荧光物质的组成、浓度以及分布情况分析^[29]，结果如图8所示。相比于原泥，经复配酶水解后化粪池底泥上清液的EPS中，I（Ex/Em为220~250 nm/280~330 nm）、II（Ex/Em为220~250 nm/330~380 nm）、IV（Ex/Em为250~380 nm/280~380 nm）区域内荧光强度较原底泥均有较为明显的增强。说明复配酶处理后底泥有机物及微生物EPS被破坏，导致大量络氨酸（I区）、色氨酸类（II区）蛋白以及微生物副产物（IV区）溶出^[30]。此外，经处理后I、II、IV这3个区域内的荧光强度（即荧光物质含量）大致为：TB-EPS≈S-EPS>LB-EPS，这可能是由于TB-EPS层的结构较为紧密，会拦截一定的有机物留于其中，而LB-EPS层的结构较为疏松^[31]，溶解性的有机物能较容易的转移到S-EPS之中。而对于V区（Ex/Em为250~450/380~540 nm）的腐殖酸类物质的含量，经复配酶处理后均略高于原底泥。这主要是由于化粪池底泥中的膳食纤维在长时间厌氧过程中可能会发生一系列的反应（微生物代谢、氧化还原、化学聚合等）转化为腐殖酸^[32]，而腐殖酸属于难降解物质^[33]，微生物自身对其利用率较低，经酶解处理后，原来包裹在底泥中的腐殖酸类物质从固相进入到了液相，使得液相中的腐殖酸类物质含量稍有增加。

经复配酶处理前后化粪池底泥的颗粒粒径分布情况如图9所示。图9结果显示，处理前后污泥的颗粒粒径分布范围相近，均在0.5~1 000 μm范围内，且均有2个峰。处理前，化粪池底泥的2个峰分别位于80 μm和450 μm附近，且位于450 μm处的峰值较高，表明此时底泥中存在的颗粒物质以大颗粒有机质为主。经复配酶处理后，位于450 μm处的峰值明显降低，而位于80 μm处的峰值逐渐升高，表明大颗粒逐渐向小颗粒转化。表2结果显示，D10、D50、D90经酶解处理后均呈降低趋势，其中D90降低显著。综上可以看出，化粪池底泥经复配酶水解后，底泥絮体的结构遭到破坏，使底泥中的大颗粒有机质逐渐被水解为小粒径颗粒，从而有利于进入上清液中，并输送到污水厂增加水厂碳源。

1）采用中性蛋白酶、α-淀粉酶及脂肪酶复配水解化粪池底泥，在中性蛋白酶∶α-淀粉酶∶脂肪酶配比4∶1∶1、投加量8%（w/w）、反应时间2 h、温度25 ℃、pH 7的条件下，复配酶水解效果较好，底泥上清液SCOD、多糖、氨氮和蛋白质分别由原始的672.10、28.88、212.89和189.82 mg·L⁻¹增加到5 492.50、3 054.48、305.56和460.77 mg·L⁻¹，化粪池底泥大部分有机质由固相转移到了液相之中。

2）经复配酶处理后，底泥表面结构变的较为松散，溶解性有机物从内部向外溶出。EPS含量变化为S-EPS>LB-EPS>TB-EPS。上清液中可生物降解的络氨酸、色氨酸类蛋白及可溶性微生物副产物等物质含量升高。复配酶有效增强了化粪池底泥结构的破坏与水解程度，提高了化粪池出水的有机质含量，有利于管网及污水厂碳源的提高。