MBBR使用的填料为聚乙烯（PE）塑料材质，具有质量轻、比表面积大、附着能力强和不易破碎等特点。实验使用2种常用规格的填料：大填料（直径2.5 cm，厚1 cm）和小填料（直径1 cm，厚1 cm）。

挂膜实验使用2个相同规格的MBBR反应器平行进行，见图1。1号反应器（R1）投放大填料，2号反应器（R2）投放小填料，投放体积比均为30%。反应器底部安装曝气盘曝气；进水流量由蠕动泵控制，排水由磁力阀控制；通过时控开关控制反应器曝气和自动进、出水。

采用接种排泥法和间歇性曝气法联合进行填料挂膜。起始阶段闷曝2 d，之后间歇曝气20 d，每6 h为1个循环，包括进水、曝气、静置和出水。在MBBR挂膜阶段采用人工模拟废水，室温运行，分别以葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾为碳、氮和磷源。在间歇曝气的前15 d，进水COD为300 mg/L，NH₃-N为10 mg/L，磷酸盐为1 mg/L；之后进水COD浓度增加至500 mg/L，NH₃-N与磷酸盐的含量也适当提升。

在实际污水处理实验中，使用5组相同的MBBR平行运行，分别按如下设置：R0为空白对照组，无填料；R1投放大填料，填充率为30%；R2投放小填料，填充率为30%；R3投放大填料，填充率为15%；R4投放小填料，填充率为15%，溶解氧（4.0±0.1） mg/L。进水使用东北大学校园内景观池塘的池水，由于深秋季节雨水较少，落叶等有机物在底层分解，使水中的污染物偏高，COD含量约为（120±5） mg/L，NH₃-N为（8±1）mg/L，实验温度（20±1） ℃，单个运行周期8 h。

实验中的COD、NH₃-N含量根据国标法进行测定，COD采用重铬酸钾法测定，NH₃-N采用纳氏试剂分光光度法测定^[9]。

在挂膜实验结束后，分别从R1和R2中随机抽取填料，利用16S rRNA基因高通量测序对填料挂膜菌群结构进行分析。扩增16S rRNA基因的V3～V4区域，引物为341F：CCT ACG GNG GCW GCA G和805R：GAC TA C HVG GTA TCT AAT CC，测序结果利用USEARCH^[10]软件进行聚类分析，相似度97%设为1个操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）。用Mothur计算Alpha多样性指数，采用Silva进行比对。

填料挂膜期间进出水的COD变化，见图2。

挂膜初期，COD的去除效率随时间的推移逐渐增高，并在8 d后达到稳定，此时，R1和R2的COD去除率分别为85.3%和86.4%。从16 d开始增加有机负荷，去除效率出现明显波动，主要因为系统中的细菌未适应负荷冲击，两组反应器去除率均较低。经过3 d左右的适应期，去除率再次达到稳定，分别为87.0%和89.3%。

挂膜期间的进出水NH₃-N变化见图3。

随着悬浮填料挂膜时间的延长，NH₃-N的去除效率逐渐增高，第8 天开始，去除速率逐渐变缓，第10 天之后达到稳定，R1和R2的NH₃-N去除率分别为66.1%和74.5%；第12 天左右R1的去除效率稍有起伏；在第16天，提高有机负荷，初期R1和R2的NH₃-N去除效果的变化趋势与COD保持一致，微生物不适应负荷变化，处理效果较差；随着对负荷的适应，去除率趋于稳定，均保持在68%左右，R2略高。

两组MBBR对COD和NH₃-N的去除效率基本相同，而两种填料的挂膜效果略有不同，见图4。

在第3天，大小填料上均出现黄褐色絮状物，但轻甩便会脱落；在6～14 d，填料上絮状物不断增多，颜色加深，轻甩不易脱落，填料上出现生物积累，初步形成生物膜，小填料上的絮状物要多于大填料；第22天，小填料生物膜厚度约为2 mm，大填料生物膜厚度约为1 mm，小填料的生物膜颜色略深于大填料。

采用接种排泥法和间歇性曝气法联合挂膜，在（20±1） ℃条件，15 d便可挂膜成功，与其他研究学者的挂膜方法进行比较，见表1，缩短了6～13 d，提高了挂膜效率。另外，随着进水污染物浓度的升高, 系统受到了负荷冲击，出水污染物浓度虽有所升高，但最终NH₃-N浓度能够稳定在5 mg/L以下，COD浓度能够稳定在70 mg/L以下，去除率波动不大。表明MBBR系统具有较强的抗冲击性能。

两种悬浮填料生物膜的微生物多样性指数，见表2。

表2可知，ACE指数，Shannon指数和Simpson指数用来评估样品的微生物多样性，Chao1指数是菌种丰富度指数。R1和R2分别获得48 360和40 068条有效序列，覆盖度均>99.9%，样品测序深度能较好地代表样品中的微生物组成，结果能有效反映样品的真实状况。R1和R2分别有453个和417个OTUs，表明2种填料上微生物种类数目存在一定的不同。

图5可知，OTU水平的Alpha指数曲线随着测序量的增加而趋于平缓，OTU不再显著上升，测序深度足够，可以反映绝大多数微生物信息。R2的曲线低于R1，表明在门水平R2的生物丰度略少于R1。

对2种填料的生物膜进行门水平的菌群分析，见图6。

R1填料上附着的生物膜中主要包括Candidatus Saccharibacteria（48.71%）、Proteobacteria（18.92%）、Bacteroidetes（9.94%）、Acidobacteria（7.21%）和Planctomycetes（6.58%）。在R2填料中，主要包括Candidatus Saccharibacteria（42.34%）、Proteobacteria（27.05%）、Planctomycetes（11.82%）、Actinobacteria（5.14%）、Acidobacteria（3.29%）和Bacteroidetes（1.87%）。2组填料生物膜的菌群结构整体相接近，但略有不同。

对比小填料和大填料生物膜的属水平的菌群结构，见图7。

在细菌的属水平上，2组MBBR填料生物膜上相对含量占比最高的优势菌属均为Candidatus Saccharibacteria门，norank Candidatus Saccharibacteria科的Saccharibacteria genera incertae sedis，占比分别为R1：48.71%、R2：42.34%，其余菌属占比较小。R1中的其他优势菌属为unclassified Rhizobiales（4.80%）、unclassified Planctomycetaceae（4.40%）、Aridibacter（2.99%）和Terrimonas（2.19%）；R2中的其他优势菌属为unclassified Enterobacteriaceae（12.38%）、unclassified Planctomycetaceae（8.80%）、Nakamurella（1.92%）和Micropruina（1.87%）。由于不同尺寸填料的表观接触面积不同，填料内部溶解氧含量存在差异，导致好氧菌和厌氧菌的菌群结构形成略有不同。前人的研究中也发现，改善进水的C/N有利于Candidatus Saccharibacteria在生物膜上的富集^[11]。Candidatus Saccharibacteria是广泛存在于自然界中的一种细菌，王伟等^[12]在对污水厂尾水处理的研究中发现，投加葡萄糖会对填料的挂膜和细菌群落产生显著影响，引起Candidatus Saccharibacteria门细菌的高度富集。2019年，Candidatus Saccharibacteria首次被报道为反硝化污泥中的主要细菌，可在缺氧条件下降解有机物并参与NO₃⁻-N的还原^[13-14]。Candidatus Saccharibacteria具有在好氧、缺氧和厌氧条件下降解多种有机污染物的能力^[15]。生物膜中还存在具有反硝化能力的Terrimonas ^[16]，与实验中2组MBBR具有较高的脱氮效率相符。R1中的unclassified Rhizobiales和R2中的unclassified Enterobacteriaceae都属于变形菌门，Proteobacteria是细菌中最大的一门，该菌门中很多细菌在降解有机物的同时可以实现脱氮除磷^[14]。unclassified Planctomycetaceae属于浮霉菌门，与厌氧氨氧化细菌属于同一菌门，该类细菌可在缺氧环境下利用亚硝酸盐氧化铵离子生成氮气，因此推测unclassified Planctomycetaceae参与了系统中的脱氮过程^[14]。在R2中，Nakamurella和Micropruina 属于放线菌门，Nakamurella是一种可以生产大量胞外多糖的细菌，有利于生物膜的形成和在填料上附着 ^[17]；Micropruina一般存在于好氧颗粒污泥中，具有很好的COD和NH₃-N去除能力^[18]，也被认为参与了好氧颗粒污泥的形成与稳定过程^[19]，而放线菌门在小填料中含量较高，推断其对小填料表面生物膜的形成有促进作用；其他占比较少的未分类菌属大多也属于变形菌门，对系统的脱氮脱磷也有一定作用。

在实际污水净化实验中，每小时均对5组反应器中的水质进行测定，见图8和图9。

实验初期，R1和R2填料的微生物迅速适应环境变化，大部分COD在此阶段被利用，COD去除效果明显高于其他3组，R3和R4的去除速率与R0基本一致；在3～4 h后，R1和R2的COD去除速率有下降趋势，R3和R4的细菌开始适应环境变化，去除速率开始增大；至8 h，除R0组，4组反应器的COD去除速率趋于稳定，其中R2组的处理效果远优于其他3组，出水COD低于5 mg/L，R1出水COD在20 mg/L左右，R3和R4均在30 mg/L左右。

图9可知，在运行初期，R1和R3的去除速率略高于其他3组，推测大填料上与脱氮相关的微生物优先适应环境变化，初期处理效果明显，其他3组反应器NH₃-N去除速率无显著差异；但在3～4 h，R2的NH₃-N去除速率迅速增大，主要由于R2中填料上微生物开始适应环境变化，同时填料的生物量较大，去除效果优于其他4组；第5 h后，5组反应器去除速率逐渐趋于平缓。将5组反应器NH₃-N去除率进行比较，发现填充率为30%的2组R1和R2的去除率高于填充率为15%的R3和R4，同时R2组的去除效果要优于R1组，R3和R4的最终去除率相等，但R3初期去除效果更好；仅R2的出水NH₃-N稳定在2 mg/L以下。

除对照组，4组反应器出水污染物浓度逐渐稳定，主要是由于反应器里的微生物总数相对有限，其污染物去除能力有限，当运行时间达到6 h之后，污染物的去除效率上升趋势逐渐平缓。

最终R0、R1、R2、R3和R4出水COD分别为82.14、18.86、31.43、3.73和24.73 mg/L，NH₃-N分别为6.57 、2.81、1.31、3.95和3.95 mg/L。通过对比可以发现，投放已挂膜的大填料与小填料的实验组处理效果显著；NH₃-N的平均去除率可达65%，COD的去除率可达到80%。

地表水环境质量标准中Ⅳ类水的COD与NH₃-N限值分别为30和1.5 mg/L，Ⅴ类水为40和2.0 mg/L。除R0外，4组反应器最终出水的COD值均低于40 mg/L，其中R2在5 h的出水COD 已低于30 mg/L。而对于NH₃-N，只有R2在8 h达到1.31 mg/L，出水水质满足地表水Ⅳ类水质标准，其余反应器均尚未满足Ⅴ类水质标准。总体来说，反应器对COD的去除效果优于对NH₃-N的去除。

当填料大小相同时，填充率为30%的实验组的生物量更高，因此，污水处理效率明显优于填充率为15%的实验组。有研究表明MBBR填料填充率为30%～40%时，对COD的去除率比在40%～50%高^[4]，填料填充率与处理效果并不完全成正比。从填料尺寸来看，相同填充率条件下，小填料与污水表观接触面积更大。聂泽兵等^[20]对3种不同尺寸填料生物膜的生物量进行了测定，表明相同曝气量的情况下，气泡对大尺寸填料生物膜的水流剪切力不足，导致老化生物膜的积累，填料内部出现厌氧区域，丝状菌大量增殖，挤压了硝化菌生存空间，降低生物活性。可以推断，小填料更有利于生长在填料表面的微生物充分利用溶解氧和基质，为异养菌营造适宜的生长条件，与大填料相比，小填料内部厌氧区较小，与硝化作用有关的Candidatus Saccharibacteria丰度较低。但是，小填料的数量较多，有利于对气泡进行切割，增加气泡停留时间，提高传质效率^[21]，使生物膜上活性差的异养菌及时脱落，保证了较高的生物量，以弥补对污水处理起主要作用的菌群丰度较低所产生的影响，因此有更好的处理效果。

使用接种排泥法和间歇性曝气法联合进行MBBR填料挂膜，在15 d基本完成挂膜，效果优于已有方法，生物膜对有机负荷和污染物波动具有较好的耐受性，且尺寸较小的填料的挂膜效率优于大填料。Candidatus Saccharibacteria是MBBR填料生物膜中的主要功能微生物，在大小填料中占比均超过40%，推断与污染物高效去除有关。MBBR投放30%填充比的小尺寸填料对实际地表水具有更好的净化效果。