群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

赵姗; 曾鸿鹄; 孙昊宇; 林志芬; 莫凌云

doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2020010606

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

1.
桂林理工大学环境科学与工程学院，桂林，541004
2.
污染控制与资源化研究国家重点实验室，同济大学环境科学与工程学院，上海，200092

通讯作者: Tel：15678316609，E-mail：457216003@qq.com，yjsb@glutedu.cn

基金项目:
同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室自主研究(重点)项目(PCRRK16007)，国家自然科学基金（21777123，21976137），水体污染控制与治理科技重大专项（2018ZX07109-1），上海市科学技术委员会科研计划课题（17DZ1200103，14DZ2261100），环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金课题（KF2016-11），111工程资助，国家博士后创新人才培养计划（BX20190247）和中国博士后科学基金（2019M661624）资助

Mechanistic explanation for time-dependent hormetic effects of quorum sensing inhibitors on bioluminescence of Aliivibrio fischeri

1.
College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin, 541004, China
2.
State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai, 200092, China

Corresponding author: MO Linyun, yjsb@glutedu.cn

Fund Project: the Foundation of the State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, China (PCRRK16007), the National Natural Science Foundation of China (21777123,21976137), the National Water Pollution Control and Treatment Science and Technology Major Project of China (2018ZX07109-1), the Science & Technology Commission of Shanghai Municipality (17DZ1200103,14DZ2261100), the State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2016-11), the 111 Project, Chinese National Postdoctoral Program for Innovative Talents (BX20190247), and Project supported by China Postdoctoral Science Foundation (2019M661624)

摘要: 群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitor，QSIs）是作用于细菌群体感应系统的一类新型抗菌药物。目前关于QSIs引起Hormesis效应的机制探究较少。本文以费氏弧菌（Aliivibrio fischeri，A. fischeri）为模式生物，测定了3种高丝氨酸内酯（N-Acyl homoserine lactone，AHL）类QSIs（AHL-QSIs）对A. fischeri生物荧光的影响，发现AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光产生了随时间变化的Hormesis效应。通过测定AHL-QSIs对A. fischeri生长量、相关蛋白表达量及模拟发光反应的影响，推测随时间变化Hormesis的机制如下：AHL-QSIs在低浓度时可以通过增强荧光素酶的活性进而促进个体发光反应，最终刺激A. fischeri的生物荧光；而当AHL-QSIs处于高浓度时，更多的AHL-QSIs不仅会通过改变细胞膜功能抑制细菌的生长，还可以与C6竞争结合LuxR影响荧光素酶的含量，最终抑制A. fischeri的生物荧光；AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光的刺激作用和抑制作用会随细菌生长阶段状态的不同而发生变化，最终导致了随时间变化的Hormesis效应。研究结果可为今后AHL-QSIs的生态风险及其进一步的广泛应用提供一定的数据基础和理论依据。
- 群体感应抑制剂 /
- Hormesis /
- 群体感应系统 /
- 费氏弧菌 /
- 随时间变化
Abstract: Quorum sensing inhibitors (QSIs), as new kind of antibacterial agents, inhibit the bacteria via acting on bacterial quorum sensing system. However, few studies explored the mechanism of hormetic phenomena induced by QSIs. In this study, Aliivibrio fischeri (A. fischeri) was used as the test organism to test the toxicities of three N-Acyl homoserine lactone-QSIs (AHL-QSIs) to the bioluminescence of A. fischeri. The results revealed that the test three AHL-QSIs induced time-dependent hormetic effects on the bioluminescence of A. fischeri. The underlying mechanism for the time-dependent hormesis can be explained by investigating the influence of AHL-QSIs on the A. fischeri growth, the relative expression of protein mRNA, and the simulated bioluminescent reaction. The stimulatory effect of AHL-QSIs on the bioluminescence might result from the promotion on the activity of luciferase. The inhibitory effect of AHL-QSIs on the bioluminescence was derived from both the inhibition on the bacteria growth and the competition with C6 to LuxR. The stimulatory and inhibitory effects of AHL-QSIs on A. fischeri bioluminescence varied with the different growth stages of bacteria, ultimately resulting in the time-dependent hormetic phenomena. This study will provide data and theoretical basis for the future application of AHL-QSIs and further exploration of their ecological risk.
- Quorum sensing inhibitors /
- Hormesis /
- Quorum sensing /
- A. fischeri /
- Time-dependent

图 1 费氏弧菌的群体感应系统

Figure 1. The quorum sensing system of A.fischeri

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 2,5-D-3(2H)-F，D-P，NV2P在2、5、12、14、19、24 h对费氏弧菌生物荧光和生长的毒性效应

Figure 2. Toxicities of 2,5-D-3(2H)-F, D-P, NV2P on the bioluminescence and growth of A. fischeri at 2, 5, 12, 14, 19 and 24 h

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 NV2P在第5 h（a）、12 h（b）和24 h（c）对luxO、litR和luxR mRNA相对表达量的影响

Figure 3. Effects of the NV2P on the relative expression of luxO,litR和luxR mRNA in A. fischeri at 5 h (a), 12 h (b) and 24 h (c)

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 （a）2,5-D-3(2H)-F，D-P，NV2P对费氏弧菌发光的急性毒性效应；（b）NV2P对费氏弧菌模拟发光反应的影响

Figure 4. (a) The acute toxicity of 2,5-D-3(2H)-F,D-P,NV2P to A. fischeri (RLU); (b) Influence of NV2P on the simulated bioluminescent reaction of A. fischeri

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 AHL-QSIs 对费氏弧菌发光促进和抑制作用机制图

Figure 5. Stimulatory and inhibitory effccts of AHL-QSIs on the bioluminescence of A. fischeri

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 实验用化合物相关信息表

Table 1. Detailed information of test chemicals

类别 Category	英文名称 English name	简称 Abbreviation	分子结构式 Molecular structure	CAS	lg (EC₅₀) (mol·L⁻¹, 24 h)
呋喃酮	2,5-Dimethyl-3(2H)-furanone	2,5-D-3(2H) F		497-23-4	−1.40
吡咯	D-Prolinol	D-P		68832−13-3	−1.78
吡咯酮	N-Vinyl-2-pyrrolidone	NV2P		88-12-0	−1.58

下载: 导出CSV

表 2 所测蛋白mRNA的引物序列

Table 2. Primer sequences used to determine the relative expression of mRNAs

目标基因	引物	序列（5’— 3’）
16S rRNA	Forward	GAGCGCAACCCTTATCCTT
16S rRNA	Reverse	ATCCGGACTACGACGCACTTT
luxO	Forward	AATTGATGCTGCAGTAGAA
luxO	Reverse	ATGCATTTGAGAGCTACTACC
litR	Forward	CTACTCGTGATGAAGTATGGC
litR	Reverse	AGATGAACTATTACGGTTAGC
luxR	Forward	ACCTGATGATTTCGCTTCT
luxR	Reverse	GGCAATATTATGATGACGCTA

下载: 导出CSV

[1]	SMITH, DAVID L H, ANTHONY D J, et al. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America, 2002, .99(9): 6434-6439. doi: 10.1073/pnas.082188899
[2]	刘丹华, 张晓伟, 张翀. 抗生素滥用与超级细菌 [J]. 国外医药(抗生素分册), 2019, 40(1): 5-8. LIU D H, ZHANG X W, ZHANG C, et al. Preliminary study on the combined toxicity of sulfa antibiotics and quorum sensing inhibitors to luminescent bacteria and its mechanism [J]. Foreign Medicine (Antibiotics Branch), 2019, 40(1): 5-8(in Chinese).
[3]	DEFOIRDT T, BRACKMAN G, COENYE T. Quorum sensing inhibitors: how strong is the evidence [J]. Trends in Microbiology, 2013, 21(12): 619-624. doi: 10.1016/j.tim.2013.09.006
[4]	KALIA V C, PUROHIT H J. Quenching the quorum sensing system: potential antibacterial drug targets [J]. Critical Reviews in Microbiology, 2011, 37(2): 121-140. doi: 10.3109/1040841X.2010.532479
[5]	郭冰怡, 董燕红. 细菌群体感应抑制剂研究进展 [J]. 农药学学报, 2018, 20(4): 408-424. GUO B Y, DONG Y H. Research progress on bacterial quorum sensing inhibitors [J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2018, 20(4): 408-424(in Chinese).
[6]	KALIA, CHANDRA V. Quorum sensing inhibitors: an overview [J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(2): 224-245. doi: 10.1016/j.biotechadv.2012.10.004
[7]	WANG T, WANG D, LIN Z, et al. Prediction of mixture toxicity from the hormesis of a single chemical: a case study of combinations of antibiotics and quorum-sensing inhibitors with gram-negative bacteria [J]. Chemosphere, 2016, 150: 159-167. doi: 10.1016/j.chemosphere.2016.02.018
[8]	ZHANG Y, SONG J, WANG T, et al. Time-dependent toxicities of quorum sensing inhibitors to Aliivibrio fischeri and Bacillus subtilis [J]. Dose-Response, 2019, 17(1): 1559325818822938.
[9]	SUN H, GE H, ZHENG M, et al. Erratum: Corrigendum: Mechanism underlying time-dependent cross-phenomenon between concentration-response curves and concentration addition curves: a case study of sulfonamides-erythromycin mixtures on Escherichia coli [J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 35899. doi: 10.1038/srep35899
[10]	DENG Z, LIN Z, ZOU X, et al. Model of hormesis and its toxicity mechanism based on quorum sensing: a case study on the toxicity of sulfonamides to photobacterium phosphoreum [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(14): 7746-7754.
[11]	MIYASHIRO T, WOLLENBERG M S, CAO X, et al. A single qrr gene is necessary and sufficient for LuxO‐mediated regulation in Vibrio fischeri [J]. Molecular Microbiology, 2010, 77(6): 1556-1567. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07309.x
[12]	KIMBROUGH J H, STABB E V. Substrate specificity and function of the pheromone receptor AinR in Vibrio fischeri ES114 [J]. Journal of Bacteriology, 2013, 195(22): 5223-5232. doi: 10.1128/JB.00913-13
[13]	LUPP C, RUBY E G. Vibrio fischeri LuxS and AinS: comparative study of two signal synthases [J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(12): 3873-3881. doi: 10.1128/JB.186.12.3873-3881.2004
[14]	LUPP C, URBANOWSKI M, GREENBERG E P, et al. The Vibrio fischeri quorum‐sensing systems ain and lux sequentially induce luminescence gene expression and are important for persistence in the squid host [J]. Molecular Microbiology, 2003, 50(1): 319-331. doi: 10.1046/j.1365-2958.2003.t01-1-03585.x
[15]	SUN H, PAN Y, GU Y, et al. Mechanistic explanation of time-dependent cross-phenomenon based on quorum sensing: a case study of the mixture of sulfonamide and quorum sensing inhibitor to bioluminescence of Aliivibrio fischeri [J]. Science of The Total Environment, 2018, 630: 11-19. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.02.153
[16]	MEIGHEN E A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes [J]. The FASEB Journal, 1993, 7(11): 1016-1022. doi: 10.1096/fasebj.7.11.8370470
[17]	JABLONSKI E, DELUCA M. Studies of the control of luminescence in Beneckea harveyi: properties of the NADH and NADPH: FMN oxidoreductases [J]. Biochemistry, 1978, 17(4): 672-678. doi: 10.1021/bi00597a018
[18]	SUN H, CALABRESE E J, ZHENG M, et al. A swinging seesaw as a novel model mechanism for time-dependent hormesis under dose-dependent stimulatory and inhibitory effects: A case study on the toxicity of antibacterial chemicals to Aliivibrio fischeri [J]. Chemosphere, 2018, 205: 15-23. doi: 10.1016/j.chemosphere.2018.04.043
[19]	SCHULTZ T W, CRONIN M T D, WALKER J D, et al. Quantitative structure–activity relationships (QSARs) in toxicology: A historical perspective [J]. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 2003, 622(1/2): 1-22. doi: 10.1016/S0166-1280(02)00614-0
[20]	SCHAEFER A L, HANZELKA B L, EBERHARD A, et al. Quorum sensing in Vibrio fischeri: probing autoinducer-LuxR interactions with autoinducer analogs [J]. Journal of Bacteriology, 1996, 178(10): 2897-2901. doi: 10.1128/JB.178.10.2897-2901.1996
[21]	GE H L, LIU S S, ZHU X W, et al. Predicting hormetic effects of ionic liquid mixtures on luciferase activity using the concentration addition model [J]. Environmental Science & Technology, 2010, 45(4): 1623-1629.
[22]	SZABADI E. A model of two functionally antagonistic receptor populations activated by the same agonist [J]. Journal of Theoretical Biology, 1977, 69(1): 101-112. doi: 10.1016/0022-5193(77)90390-3

点击查看大图

图( 5) 表( 2)

计量

文章访问数: 3017
HTML全文浏览数: 3017
PDF下载数: 47
施引文献: 0

全文HTML

抗生素由于良好的抑菌杀菌性能被广泛应用于医疗卫生、禽畜及水产养殖等领域^[1]。然而，由于抗生素滥用导致大量耐药菌产生，引发了一系列难治性感染。因此，探索和研发抗生素的替代品变得迫在眉睫^[2]。群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitor，QSIs）是作用于细菌群体感应（quorum sensing，QS）系统的一类新型抗菌药物，它可以通过抑制信号分子合成、促进信号分子降解、阻断信号分子与受体结合以及抑制信号分子级联转导水平等方式抑制细菌的QS系统^[3]。相比于传统抗生素，QSIs不会直接对细菌产生毒性作用，不易使细菌产生耐药性^[4]。因此，QSIs被认为是未来最理想的抗生素替代品。根据化学结构的不同，QSIs可分为二酮呱嗪类、酰基高丝氨酸内酯类（N-Acyl homoserine lactone，AHL）、寡肽类以及激素类^[5]等。其中，高丝氨酸内酯类QSIs（本文简称为AHL-QSIs）最为引人关注，其作用机制是与AHL信号分子竞争结合受体蛋白来干扰QS系统^[6]。鉴于AHL-QSIs在医疗及养殖领域中广泛的应用前景，有必要探究其潜在的生态风险。

目前，已有研究者探索了AHL-QSIs对细菌的毒性作用，发现其可以对细菌产生低浓度刺激、高浓度抑制的毒物兴奋效应（即Hormesis效应）。例如，Wang等^[7]等在测定6种AHL-QSIs（3-苯并呋喃酮、D-脯氨醇、2-甲基四氢呋喃-3-酮、(R)-羟基四氢吡咯、γ-戊内酯、1-(1-吡咯烷)环己烯）对大肠杆菌的生长毒性效应时发现，这些AHL-QSIs在第14 h会对大肠杆菌的生长产生Hormesis效应。Zhang^[8]等的研究表明，呋喃酮乙酸酯（一种AHL-QSIs）对枯草芽孢杆菌的生长在第3 h也有明显的Hormesis效应。虽然AHL-QSIs对细菌的Hormesis效应已被人们发现，但关于这种效应的具体机制还有待进一步探索。已有研究表明，细菌Hormesis效应的发生与细菌自身的QS系统密切相关。例如Sun^[9]等发现磺胺类抗生素引起大肠杆菌生长的Hormesis效应可能是由磺胺类抗生素作用于QS系统中的关键蛋白并刺激其表达所导致。Deng^[10]等在研究磺胺类抗生素对明亮发光杆菌的毒性效应时也发现，Hormesis效应源于磺胺类抗生素作用于明亮发光杆菌的QS系统。鉴于以上研究进展，探索AHL-QSIs对细菌的QS系统的作用，可能是了解AHL-QSIs诱导Hormesis效应并阐明其作用机制的一个有效手段。

费氏弧菌（Aliivibrio fischeri，A. fischeri）是首次发现具有QS现象的革兰氏阴性菌^[11]，其QS系统较为清晰，如图1所示，主要调控A. fischeri的生物荧光^[12-14]。在细菌缺乏C8信号分子和AI-2信号分子时，磷酸化的AinR蛋白和磷酸化的LuxP/Q蛋白会将磷酸分子传递给LuxU蛋白，再传递给LuxO蛋白，而磷酸化的LuxO蛋白是qrr1基因的转录激活剂，可以激活qrr1基因编码产生Qrr1蛋白；Qrr1蛋白在蛋白Hfq的协同作用下会抑制litR基因向LitR蛋白的编码，从而阻断后续的信号通路。当信号分子C8和AI-2含量增加时，磷酸转移路径会被抑制，导致LitR蛋白稳定表达，继而转录激活luxR基因，编码LuxR蛋白；LuxR蛋白能够和信号分子C6结合形成复合物，激活luxICDABEG基因；luxA和luxB两种基因能够分别编码荧光素酶的α亚基和β亚基^[15]，而荧光素酶能够催化A. fischeri体内的生物发光反应，进而产生生物荧光。

本课题组前期实验发现，AHL-QSIs对A. fischeri的发光在延滞期具有Hormesis效应，且这种Hormesis效应会随生长周期的变化而变化^[9]。因此本文以A. fischeri为受试模式生物，3种AHL-QSIs（2(5H)-呋喃酮（2(5H)-Furanone，2,5-D-3(2H)-F）、D-脯氨醇（D-Prolinol，D-P）以及N-乙烯基吡咯烷酮（N-Vinyl-2-pyrrolidone，NV2P））为受试化合物，测定了它们对A. fischeri生物荧光、生长量、相关蛋白表达量以及模拟发光反应的影响。初步探究了AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光随时间变化的Hormesis效应及其机制，以期为AHL-QSIs的后续应用以及使用及环境生态风险评价提供研究基础。

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1. 试剂与生物

2,5-D-3(2H)-F、D-P以及NV2P均购自Sigma-Aldrich化学制品有限公司（圣路易斯，密苏里州，美国），纯度均为分析纯（98%）以上，具体信息见表1。

实验模式生物A. fischeri（ATCC7744）购自美国模式培养物保藏所（马纳萨斯，维吉尼亚州，美国）。A. fischeri在培养24 h后，其生长周期可以分为3个阶段：（1）延滞期（1—8 h），细菌生长缓慢并且生物荧光较低，此时QS较弱，C6和LuxR的浓度较低；（2）对数期（9—17 h），细菌快速生长并且生物荧光快速增加，此时QS较强，有大量的C6和LuxR产生；（3）平台期（18—24 h），细菌的生长逐渐减缓并且生物荧光减弱，此时QS开始逐渐变弱，C6和LuxR的产生也逐渐变少^[16]。

1.2. 工作菌液配制

在无菌操作台上，用灭好菌的接种环接取适量菌种放入5 mL的单倍液体培养基中，置于22 ℃培养箱中振荡培养至对数生长期（12 —14 h）成为摇瓶菌液。实验时取0.2 mL摇瓶菌液加入40 mL的2%氯化钠溶液中，持续搅拌40 min后用于毒性试验。

1.3. 毒性实验

（1）慢性毒性实验

取待测化合物用适量DMSO配制成标准溶液，实验时用2%（质量分数）NaCl稀释成等对数梯度系列，取80 μL加入96孔板中。同时取80 μL的2% NaCl作为对照。在每个样品中加入80 μL 2.5倍培养基和40 μL的工作菌液（初始发光值需调至12000—15000）。每个浓度点至少做3个平行。振荡、混匀，放入Luminoskan Ascent发光分析仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国）或Bioscreen C全自动生长分析仪（Bioscreen测试服务股份有限公司，美国）中培养24 h，每隔1 h测定RLU（relative light units，相对光度单位）或OD₆₀₀（optical density，光密度）值。

（2）急性毒性实验

急性毒性实验的方法与慢性毒性方法类似，急性毒性实验是将A. fischeri直接暴露于不同浓度的污染物，不需要加入2.5倍培养基，15 min后测定每个浓度点的毒性；慢性毒性实验则是将 A. fischeri直接暴露于不同浓度的污染物，但是需要加入2.5倍培养基，24 h后测定每个浓度点的毒性。在急性毒性实验中，暴露时间较短，细菌数目变化很小，因此仅以生物荧光作为测试终点。首先配制待测化合物标准溶液，实验时用 2% NaCl 稀释成等对数梯度系列，取 80 μL加入96孔板相应位置（例如：2,5-D-3(2H)-F设置了16个浓度点，分别为lgC=−3.87，−3.74，−3.62，−3.48，−3.36，−3.23，−3.10，−2.97，−2.87，−2.74，−2.62，−2.48，−2.36，−2.23，−2.10，−1.97 mol·L⁻¹），空白样加入80 μL的 2% NaCl溶液；每个孔中再各加入80 μL 2% NaCl溶液，并加入40 μL工作菌液（初始发光值需调至200000左右）。其中，每个浓度点至少做3个平行。振荡混匀后静置15 min，于酶标仪（Mithras LB940，德国伯托科技有限公司，德国）测定RLU值。

（3）毒性表征

化合物毒性用其对A. fischeri的发光抑制率和生长抑制率表征，如式（1）所示:

其中，X₀代表对照组的RLU值或者OD₆₀₀值，X代表实验组的RLU值或者OD₆₀₀值，对照组和实验组均为3组平行。

1.4. 蛋白质mRNA相对表达量测定实验

在暴露于一系列浓度（lgC=−6.07，−5.81，−5.55，−5.29，−5.07，−4.81，−4.55 mol·L⁻¹）的受试化合物之后，通过实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR, qPCR）测定A. fischeri中LuxO、LitR及LuxR蛋白mRNA的相对表达量。首先，使用总RNA提取试剂盒（Total RNA Kit，Omega 生物科技有限公司，美国）提取A. fischeri中的总RNA。然后，在Applied Biosystem Veriti热循环仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国）上，使用PrimeScript^TM 1st stand cDNA合成试剂盒（Takara生物技术有限公司，日本）对1 μg 的RNA进行逆转录，生成cDNA。最后，在7500 实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国）上利用SYBR@ Premix Ex Tap^TM II 试剂盒（Takara生物技术有限公司，日本）使cDNA进行多聚核苷酸链式反应，PCR参数为：（1）95 ℃，30 s；1个循环；（2）95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40个循环；（3）95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；15个循环；（4）95 ℃，15 s；60 ℃，15 min。所测蛋白mRNA的引物序列是基于ncbi数据库序列，如表2所示。实验设置3组平行，结果以平均值±标准偏差的形式展示。在进行柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验之后，使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad软件公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国）对实验结果进行单因素方差分析及Tukey多重比较检验来判别实验组和对照组之间的差异。差异的显著性分为：P<0.05、P<0.01、P<0.001，分别用#，##和###表示蛋白LuxO mRNA相对表达量的下降；分别用*，**和***表示蛋白LitR mRNA相对表达量的下降;分别用^，^^和^^^表示蛋白LuxR mRNA相对表达量的下降。

1.5. 发光反应体外模拟实验

A. fischeri的生物荧光来源于荧光素酶催化的发光反应^[17-18]（式2），

根据Sigma-Aldrich化学品有限公司（圣路易斯，密苏里州，美国）提供的荧光素酶活性检测方法对A. fischeri的发光反应进行了模拟，探究了受试化合物对体外模拟发光反应的影响。实验在96孔板中进行，每孔按顺序依次加入100 μL的Sorensen缓冲溶液（pH值为6.8，由KH₂PO₄和Na₂HPO₄组成）、10 μL的巯基乙醇、100 μL的化合物（作为实验组）或超纯水（作为对照组）、10 μL的荧光素酶、10 μL的还原型辅酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，简称NADH）、10 μL的黄素单核苷酸（Flavin mononucleotide，简称FMN）和10 μL的癸醛。在25 ℃下反应15 min之后，在酶标仪（Mithras LB940，德国伯托科技有限公司，德国）上对每孔连续测定10 s以获得每孔反应的RLU值。毒性结果采用抑制率（式3）来表示：

其中，RLU₀为对照值，RLU为实验值，对照组和实验组均为3组平行。

3. 结论（Conclusion）

本研究表明，AHL-QSIs对A. fischeri的生物荧光均产生了随时间变化的低浓度促进、高浓度抑制的Hormesis现象。当AHL-QSIs在低浓度时可以通过增强荧光素酶的活性进而促进个体发光反应，最终刺激A. fischeri的生物荧光；随着AHL-QSIs浓度的增加，更多的AHL-QSIs不仅会改变细胞膜的通透性而抑制细菌的生长，还可以与C6竞争结合LuxR减少荧光素酶含量，最终抑制A. fischeri的生物荧光。另外，在细菌不同的生长阶段，AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光的刺激作用和抑制作用会随细菌生长状态的不同而发生改变，随时间变化的刺激作用和抑制作用的相互作用最终导致了其Hormesis效应随时间的变化而变化。

本文将有助于为AHL-QSIs的环境生态风险评价提供研究基础，并为其对A. fischeri生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制提供参考。

参考文献 (22)

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

通讯作者: Tel：15678316609，E-mail：457216003@qq.com，yjsb@glutedu.cn

Mechanistic explanation for time-dependent hormetic effects of quorum sensing inhibitors on bioluminescence of Aliivibrio fischeri

Corresponding author: MO Linyun, yjsb@glutedu.cn

计量

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

通讯作者: Tel：15678316609，E-mail：457216003@qq.com，yjsb@glutedu.cn

English Abstract

Mechanistic explanation for time-dependent hormetic effects of quorum sensing inhibitors on bioluminescence of Aliivibrio fischeri

Corresponding author: MO Linyun, yjsb@glutedu.cn

全文HTML

1.1. 试剂与生物

1.2. 工作菌液配制

1.3. 毒性实验

1.4. 蛋白质mRNA相对表达量测定实验

1.5. 发光反应体外模拟实验

2.1. AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光和生长的毒性效应

2.2. AHL-QSIs对A. fischeri中蛋白mRNA的相对表达量的影响

2.3. AHL-QSIs对A. fischeri个体发光反应的影响

2.4. AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

目录

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

通讯作者: Tel：15678316609，E-mail：457216003@qq.com，yjsb@glutedu.cn

Mechanistic explanation for time-dependent hormetic effects of quorum sensing inhibitors on bioluminescence of Aliivibrio fischeri

Corresponding author: MO Linyun, yjsb@glutedu.cn

计量

出版历程

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

通讯作者: Tel：15678316609，E-mail：457216003@qq.com，yjsb@glutedu.cn

English Abstract

Mechanistic explanation for time-dependent hormetic effects of quorum sensing inhibitors on bioluminescence of Aliivibrio fischeri

Corresponding author: MO Linyun, yjsb@glutedu.cn

全文HTML

1.1. 试剂与生物

1.2. 工作菌液配制

1.3. 毒性实验

1.4. 蛋白质mRNA相对表达量测定实验

1.5. 发光反应体外模拟实验

2.1. AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光和生长的毒性效应

2.2. AHL-QSIs对A. fischeri中蛋白mRNA的相对表达量的影响

2.3. AHL-QSIs对A. fischeri个体发光反应的影响

2.4. AHL-QSIs对A. fischeri生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

目录