木黄酮是一种常见的植物雌激素^[19]，可模拟雌激素功能与鱼类雌激素受体竞争性结合；此外，木黄酮还可通过抑制芳香化酶以及调控基因转录等方式对鱼类的生殖系统产生毒性作用，主要表现为经木黄酮饲养后鱼类的性腺重量下降，精子与卵细胞数量、质量下降，性激素水平升高。

性体指数（Gonadal somatic index，GSI）是动物的卵巢或睾丸重量与体重的比值。对于鱼类而言，该指标可以衡量其生殖腺的相对大小^[20]，反映不同鱼类性腺发育的总体水平。木黄酮对鱼类GSI的影响因鱼类品种、暴露时间、木黄酮含量的不同而表现出差异性。Bagheri等^[21]研究发现，用含有不同浓度木黄酮（0.22、0.46、0.68 μg·L⁻¹）的饲料饲喂金鱼（Carassius auratus）7个月，在雌鱼和雄鱼中都观察到了GSI降低的现象，且其下降趋势与木黄酮含量的增加趋势相吻合：实验结束时，雌鱼与雄鱼中木黄酮含量最高的暴露组与对照组GSI的差值分别为5%和3%；其另一项研究^[22]进一步发现，在使用相同梯度的饲料饲喂2年后（从20周龄到第一次产卵），雌鱼与雄鱼中同样出现了GSI下降的现象，但与之前的研究不同的是，上述差值分别达到了9%和7%。以上研究结果显示，一定浓度的木黄酮长期暴露对鱼类性腺具有生长抑制作用，且随着木黄酮含量增加、暴露时间延长，其抑制作用更为明显。这说明木黄酮对鱼类性腺的抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性。

精子与卵细胞作为生殖细胞，其数量和质量是评估鱼类生殖能力的重要因素之一，而木黄酮对它们的影响主要表现为延迟其产生和发育，从而阻碍生殖细胞的成熟，最终表现为原始生殖细胞增多，间质组织增生，精子浓度和比容下降等。由于木黄酮具有雌激素活性，鱼类卵细胞受影响更明显。Nuzaiba等^[23] 将雌性鲤鱼分成5组，用木黄酮含量分别为0、10、30、60、90 mg·kg⁻¹的饲料喂养60 d后对其卵巢进行了组织学分析，发现对照组中处于卵黄增生期（Ⅲ期）的卵母细胞占总数的64.51%，其胞浆丰富，充满卵黄颗粒、脂肪滴，细胞中央有大的生发泡；而暴露组中的卵母细胞则主要处于皮质泡期（Ⅱ期），细胞外周有许多皮质小泡，而卵黄颗粒较少^[24]，即暴露组卵母细胞的发育落后于对照组；这个推测也在卵母细胞直径的测量中得到了证实：随着暴露组木黄酮含量的增加，直径位于0.35—0.45 mm区间（处于卵黄增生期）的细胞比例显著小于对照组。该研究表明，木黄酮对鱼类卵细胞的影响主要发生在其发育的早期（Ⅱ期），这可能是因为木黄酮下调了卵黄蛋白原相关基因vgtb2的转录水平及其蛋白的表达水平，从而阻碍了卵黄颗粒的产生，使卵母细胞无法正常生长和成熟。Maskey等^[25]用人绒毛促性腺激素（HCG）诱导斑马鱼（Danio rerio）的卵母细胞发生核分裂，之后暴露于木黄酮溶液中，观察暴露后出现核分裂的卵母细胞（GVBD）占所有卵母细胞的比例，结果发现当木黄酮溶液浓度为8.1 mg·L⁻¹和81 mg·L⁻¹时此比值较对照组下降超过20%，说明木黄酮对斑马鱼卵母细胞的成熟具有一定的抑制作用。这很可能是木黄酮竞争性结合斑马鱼卵母细胞的雌激素受体，进而抑制HCG促进卵母细胞成熟的作用，最终表现为木黄酮抑制斑马鱼卵母细胞的成熟进程。雌性青鳉鱼的木黄酮暴露实验中^[26]也出现了卵巢中原始生殖细胞增多，卵母细胞闭锁、成熟延迟以及间质组织增生等生殖毒性效应。

木黄酮的生殖毒性效应在雄性鱼类中也有所体现。雄性青鳉鱼暴露于1000 μg·L⁻¹的木黄酮溶液中100 d，其性腺呈现双性改变，即组织学表现为精巢-卵巢：在精巢组织各处分布有未成熟的卵母细胞，而这可能会导致其精子产生数量减少、质量下降^[26]；Nezafatian等^[27]给成熟雄性银鲫（Carassius auratus gibelio）腹腔注射5 μg·g⁻¹（体重）或50 μg·g⁻¹（体重）的木黄酮溶液，隔天注射一次，持续10 d，通过检测精子质量、精巢组织学分析、受精率和后代存活率等指标来确定木黄酮对其生殖能力的影响。结果发现，50 μg·g⁻¹（体重）木黄酮暴露组雄鱼每毫升精液的精子数量为16.35×10⁶ 个，显著低于对照组的26.05×10⁶ 个；其精子比容也较对照组下降15%以上；两暴露组子代的受精率与孵化后6天存活率分别比对照组下降了44%和8%左右。此外，组织学分析表明，木黄酮使雄鱼精巢中的精母细胞数量增多，精子细胞与精子的数量减少，说明木黄酮通过抑制银鲫精原细胞的发育与增殖，从而影响了精子浓度和比容，使受精率和后代存活率下降。研究同时发现木黄酮影响子代受精率与孵化率可能与其抑制细胞增殖相关的酪氨酸激酶受体活性有关。

性类固醇激素在许多生理过程中发挥着重要作用，特别是在脊椎动物的繁殖过程中。木黄酮对鱼类性激素水平的影响主要是使17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）与睾酮（Testosterone，T）浓度升高。

Yousefi 等^[28]研究发现，用含有不同浓度木黄酮（0、200、400、800、1600 mg·kg⁻¹）的饲料饲喂雌性白鲟（Huso huso）一年，观察到其血浆中睾酮和雌二醇浓度的显著升高；Nuzaiba等 ^[23]在对鲤鱼的研究中也发现了相似的现象。木黄酮能够使鱼类的睾酮水平升高的原因可能是它可以抑制芳香化酶P450（Cytochrome P450 aromatase，cyp19a）的活性，而cyp19a是促使睾酮转化为雌二醇的关键生物酶^[29-30]；鱼类雌二醇水平升高可能是由于木黄酮增加了血清中胆固醇向卵巢的转运，激活PKA通路，上调了将胆固醇转化为孕烯醇酮的相关基因Cyp11a1的转录，从而增加了血浆中雌二醇的水平^[31-32]。

木黄酮对鱼类生殖的遗传效应除了降低成鱼受精率、鱼卵孵化率和提高幼鱼死亡率之外，还诱导鱼卵孵化过程中发生畸形，主要表现为脊柱后凸、卵黄囊水肿、体长缩短、干扰性别分化等，且这些效应在多种鱼类的生命早期发育过程中都有出现。

Sarasquete等 ^[33]用不同浓度梯度的木黄酮（从1.25 mg·L⁻¹到20 mg·L⁻¹）对受精后2—3 h（2—3 hpf）的斑马鱼胚胎染毒96 h，观察木黄酮对斑马鱼鱼卵的急性毒性效应，结果发现，胚胎和幼鱼的死亡率从5 mg·L⁻¹开始呈浓度和时间依赖性增加；所有幼鱼（96 hpf）在10 mg·L⁻¹和20 mg·L⁻¹的剂量范围内发生死亡，并表现出脊柱弯曲、体长缩短、卵黄囊水肿等常见畸形。木黄酮类似的生殖遗传毒性也在青鳉鱼、黑头软口鲦（Pimephales promelas）中被发现^[34-35]。Ren等^[36]则进一步确定，当木黄酮溶液浓度为5.4 mg·L⁻¹时斑马鱼胚胎畸形率为100%，死亡率为84%，孵化率低于75%；若浓度增加到13.5 mg·L⁻¹，其死亡率可高达98%，而孵化率与畸形率与5.4 mg·L⁻¹处理时相当。木黄酮导致胚胎出现畸形和死亡的原因可能是其下调了雌激素依赖性的HOX基因，打乱了胚胎正常的体轴发育和分化，从而使胚胎发育出现畸形^[33,37]；也有研究认为，木黄酮激活了细胞中的p53通路，p53基因通过活化BCL-2结合组件3（bbc3）诱导细胞色素c释放，进而激活半胱氨酸蛋白酶3（caspase3），从而导致核碎裂、核凝聚，引发生殖细胞凋亡^[34]。Dimaggio等 ^[38]发现，木黄酮还会干扰比目鱼（Pleuronectiformes）的性别分化，增加其群体中的雌性数量，并减慢其生长速度。

也有研究证实木黄酮对斑马鱼胚胎的心脏和血管发育具有抑制作用。Kim等^[39]将24 hpf的斑马鱼胚胎分别暴露于不同浓度（6.75、13.5、27 mg·L⁻¹）的木黄酮和乙醇（质量分数0.1%，对照组）溶液中60 h，在浓度为6.75 mg·L⁻¹组的胚胎中观察到了心包水肿的现象；另外，所有暴露组在经过木黄酮处理后30 h的每分钟心率与对照组相比也都出现了不同程度的降低，并且这种降低具有浓度依赖性：3个暴露组的每分钟心率分别比对照组减少20，40，70次以上；60 h后，木黄酮浓度为13.5 mg·L⁻¹和27 mg·L⁻¹组的胚胎全部死亡。木黄酮降低心率的机制可能是其酪氨酸激酶拮抗效应^[40]，在高浓度时抑制了心肌钙离子通道的活性，从而对心肌细胞产生负性变时作用，使心率下降；后续实验也证实，这种心率减慢现象可以被异丙肾上腺素通过活化酪氨酸激酶来改善。另外，暴露于木黄酮后的胚胎在血管形成方面也会受到抑制。将24—26 hpf的斑马鱼胚胎人工脱氯，转移到含5 mL E3培养基和200 μmol·L⁻¹ 丙硫氧嘧啶（PTU）的培养皿中，加入浓度为2.7 mg·L⁻¹的木黄酮溶液处理48 h，用荧光显微镜观察血管系统的发育。结果发现，木黄酮的抗血管生成作用在胚胎染毒早期阶段（24 h）表现得更加明显，并且具有浓度依赖性^[41-42]。由此可见，木黄酮对鱼类胚胎心血管系统的急性毒性影响较为明显，心包水肿、心率降低和抗血管生成均可在大体上观测到；心率降低发生在心包水肿之前，这提示斑马鱼胚胎的心脏发育畸形可能是心率受到影响之后的一种失代偿反应；同时，木黄酮的上述毒性作用均具有浓度依赖性，若浓度过高，在心血管毒性增强的同时也会导致胚胎的死亡。

一定浓度的木黄酮也表现出一定的神经毒性作用，影响鱼类的神经系统发育与功能^[43]，木黄酮可通过激活p53信号通路、下调参与神经系统发育调控的基因转录等进而诱导神经细胞凋亡；此外，木黄酮也会使鱼类大脑中神经递质的分泌水平发生改变。

Sassi-Messai等 ^[44]将斑马鱼胚胎暴露于浓度为0.675 mg·L⁻¹的木黄酮溶液和浓度为0.27 mg·L⁻¹的雌二醇溶液中7 h，用吖啶橙染色后在荧光显微镜下分析细胞的凋亡情况，证实木黄酮会诱导斑马鱼胚胎后脑和前脊髓细胞的凋亡，而雌二醇并不会产生以上效应，这说明木黄酮诱导的神经细胞凋亡是非雌激素受体依赖性的。他们还发现，木黄酮暴露后，参与斑马鱼神经系统发育调控的基因受到干扰，其大脑形态发生所需的OTX家族^[45]转录因子下调，这可能也是神经细胞凋亡的原因之一。

Clotfelter等^[46]将成熟的雄性斗鱼暴露在环境剂量（1 μg·L⁻¹）和药理剂量（1000 μg·L⁻¹）的木黄酮溶液中28 d，发现其在两种剂量下都能提高鱼前脑中的多巴胺水平；他的另一项研究^[47]表明，暴露在上述两种浓度下的斗鱼，镜子诱导的攻击行为减少，而这可能是因为木黄酮下调了斗鱼的雄激素水平，从而对其攻击行为产生抑制效应。

木黄酮对鱼类肝脏的影响主要表现在肝脏、血清胆固醇水平的改变和诱导核苷酸合成。这些影响主要通过上调低密度脂蛋白受体（LDLR）、雌激素受体1（ESR1）、卵黄蛋白原（Vtg1）的转录和表达水平及干扰谷氨酸代谢等途径实现。

Chen等^[31]对10月龄黄鲶鱼（Tachysurus fulvidraco）腹腔注射不同浓度的木黄酮10 μg·g⁻¹（体重），100 μg·g⁻¹（体重）溶液100 µL，24 h后分别测定其血浆、肝脏中的胆固醇水平，发现高、低剂量的木黄酮均可增加肝脏的总胆固醇含量，降低血清游离胆固醇，导致低胆固醇血症。这种效应可能通过激活胆固醇代谢中的关键转录因子SREBP-2来上调低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达实现。Licata等 ^[48]发现，斑马鱼暴露于木黄酮溶液后，其肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）免疫组化染色呈现Vtg阳性，可能是因为木黄酮作为雌激素类似物激活了雌激素受体，导致Vtg的产生。Olsvik等 ^[49]将大西洋鲑鱼（Salmo salar）肝细胞暴露于4 种浓度的木黄酮溶液0.027、0.27、2.7、27 mg·L⁻¹中48 h，发现其浓度在27 mg·L⁻¹及以下时无细胞毒性，但芳香化酶（cyp1a1）的转录水平在27 mg·L⁻¹时显著上调；木黄酮浓度为10 µmol·L⁻¹时雌激素受体1（ESR1）和卵黄蛋白原（Vtg1）的转录水平上调最明显；木黄酮还干扰谷氨酸代谢和葡萄糖的动态平衡，并诱导合成尿苷和嘧啶。Cleveland 等^[50] 对5月龄虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）幼鱼腹腔注射木黄酮溶液，24 h后取肝脏，发现木黄酮不仅上调Vtg和雌激素受体α1（erα1）的表达水平，还改变肝脏生长激素/胰岛素样生长因子轴的组成成分，包括增加胰岛素样生长因子结合蛋白2b1（igfbp2b1）的表达和降低胰岛素样生长因子5b1（igfbp5b1）的表达。

由此可见，木黄酮对鱼类肝脏的毒性机制主要是通过上调或下调分子通路中受体的转录和表达来影响物质的合成和代谢，而并没有影响肝脏细胞的生长发育和鱼类正常的生命活动。因此，木黄酮的肝脏毒性与其他系统的毒性作用相比较小。

木黄酮对鱼类的毒性作用因鱼类品种、发育时期、处理方式、干预浓度等的不同而表现出差异性，故将本文中鱼类经过木黄酮处理后表现出的各方面毒性作用整理如表1。从表1总结出在建立木黄酮染毒模型时的一些规律。

（1）鱼类品种。由于斑马鱼具有胚胎透明、生长周期短、给药方便、产卵量大等优点^[51]，故常用其胚胎观察木黄酮的发育毒性，具体表现在受精率、孵化率、死亡率的变化和胚胎发育过程中的畸形。

（2）性别及发育时期。观察生殖毒性和肝脏毒性时一般选用处于生殖期内的成鱼，而观察发育毒性常选用受精后几小时内的鱼类胚胎。

（3）暴露方式。溶液染毒和饲料喂养是较为常用的两种暴露方式。原因可能是配置溶液能保证所有实验动物染毒的一致性、没有鱼类生长发育时期的限制，而饲料易获得、来源广、成本低。腹腔注射的方式能将鱼类接触的木黄酮含量控制得更加精确，但由于操作较为复杂且必须使用成鱼，因此腹腔注射有一定的局限性。

（4）木黄酮含量（浓度）。如前所述，环境水体中木黄酮含量虽然因为地区和水域的不同而不同，但大致在ng·L⁻¹到μg·L⁻¹范围内^[8]，而本综述调研的文献中所用木黄酮的含量（浓度）稍高于上述范围，是因为本文着重研究在富含木黄酮的饲料应用日渐广泛以及水体存在污染时（如在造纸厂、漂白厂附近，木黄酮浓度较高），木黄酮对水生鱼类产生的毒性作用。因此，实验中鱼类所表现出的毒性效应反映了特殊情况下水体中的高浓度木黄酮对鱼类生长、发育、繁殖等活动的影响，对水产养殖中饲料种类的选择和投放、工农业污水处理方式和技术方面起到一定指导作用。

（5）暴露时间。木黄酮的染毒时间段主要集中在96 h内和20 d左右。因此，研究木黄酮的急性毒性效应可将染毒时间控制在48—96 h，研究其亚慢性毒性效应可将时间控制在21—28 d。

（6）毒性表现。木黄酮对鱼类生殖和发育方面毒性较大，其造成的影响通常肉眼可见，而对鱼类肝脏和神经系统的毒性不大，主要表现为特定基因转录水平的改变，基本不会影响鱼类的生存。

近年来，已有大量文献报道了水体中植物雌激素对鱼类的毒性影响。其中，有关木黄酮的研究主要聚焦于对鱼类胚胎、生殖系统、肝脏的表观毒性，或通过qPCR技术、转录组学方法探究木黄酮干预后鱼类基因表达的变化情况。目前，关于木黄酮对鱼类的毒性研究主要集中在其被添加于鱼类饲料后产生的影响和胚胎毒性作用。故本文结合近年来相关研究报道从生殖、发育、肝脏、神经等4个方面较系统性探讨并综述了木黄酮暴露对鱼类的毒性作用。尽管目前研究已获得许多重大进展，但仍存在以下局限性：木黄酮溶液染毒成鱼模型观察结果较少；由于染毒方式不同（配置成溶液、将木黄酮添加到鱼类饲料中喂养、腹腔注射等）使不同研究中木黄酮实际含量难以确定，从而导致成年鱼类对木黄酮耐受的安全范围不明确；木黄酮对成年鱼类子代的遗传毒性研究不完善等。因此，未来研究可在现有大量亚慢性及慢性毒性实验的基础上，通过对木黄酮溶液染毒模型进行成年鱼类及其遗传毒性的研究，进一步探讨木黄酮暴露对鱼类生殖系统的危害；同时，针对已有的全基因组芯片筛查结果，进一步关注相关信号通路串联在性腺组织学改变、激素水平变化、胚胎畸形等过程中的具体调控机制。不断深入探究木黄酮暴露对于鱼类的毒性作用，对于日后评价生态环境安全及合适的防治靶点具有重要的现实和理论价值。这些理论也可以成为研究其他种类植物激素对生物影响的依据。