二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

胡晓旭; 许彤; 陈旸升; 谢群慧; 郝艳芬; 王楚; 程劼; 王璞; 张庆华; 徐丽; 赵斌

doi:10.7524/j.issn.0254-6108.2021102804

二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

1.
中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京，100085
2.
中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京，100081
3.
江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，环境与健康学院，武汉，430056
4.
中国科学院大学，北京，100049

通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn;

基金项目:
国家重点研发计划（2017YFC1600301）和国家自然科学基金（22076216, 21836004）资助.

Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs

1.
State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100085, China
2.
Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China
3.
Hubei Key Laboratory of Environmental and Health Effects of Persistent Toxic Substances, Institute of Environment and Health, Jianghan University, Wuhan, 430056, China
4.
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100049, China

Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ;

Fund Project: National Key Research and Development Program of China (2017YFC1600301) and the National Natural Science Foundation of China （22076216, 21836004）

摘要: 旨在研究食用被PCDD/Fs污染的饲料对奶牛血液代谢组的影响。选择飞灰作为PCDD/Fs的载体，暴露期间将30 g飞灰与40 kg奶牛饲料均匀混合，使用配制的污染饲料饲喂奶牛，连续饲喂38 d后采集血液。采用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对血液进行代谢组学分析，并且结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对代谢轮廓进行模式识别分析并筛选差异代谢产物。共鉴定差异代谢物50个，主要为氨基酸、胆酸、磷脂与脂肪酸类成分。将差异代谢物进行通路分析并注释，涉及19条代谢通路，主要与氨基酸、脂肪酸及胆碱代谢相关。PCDD/Fs暴露干扰了奶牛的脂肪酸代谢、氨基酸代谢、磷脂代谢、胆汁酸代谢，可作为PCDD/Fs暴露的靶标代谢通路供进一步的研究。
- 二恶英 /
- 奶牛 /
- 代谢组学 /
- LC-MS
Abstract: The aim of this study was to explore the influence of PCDD/Fs pollution on the blood metabolism of cows. Fly ash was selected as the carrier of PCDD/Fs, 30 g of fly ash and 40 kg of cow feed were homogeneously mixed during exposure, the prepared polluted feed is used for feeding cows, and blood is collected after continuous feeding for 38 days. Using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) technology to analyze blood metabolism, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were combined to conduct pattern recognition analysis on metabolic profiles and screen differential metabolites. A total of 50 different metabolites were identified, mainly amino acids, bile acids, phospholipids, and fatty acids. Differential metabolites were subjected to pathway analysis and noted. There were 19 metabolic pathways involved, mainly related to the metabolism of amino acids, fatty acids and choline. In summary, the results showed that PCDD/Fs exposure interfered with fatty acid metabolism, amino acid metabolism, phospholipid metabolism and bile acid metabolism of cows, and it could be used as the target metabolic pathway of PCDD/Fs exposure for further research
- PCDD/Fs /
- cow /
- metabolomics /
- LC-MS

图 1 叠加离子流图

Figure 1. Superimposed ion current map

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图 2 所有样本PCA散点图

Figure 2. PCA scatter plot for all samples

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图 3 暴露前后正负离子模式下的OPLS-DA图

Figure 3. OPLS-DA plots in positive and negative ion modes before and after exposure

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图 4 代谢通路分析

Figure 4. Metabolic pathway analysis

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图 5 热图分析

Figure 5. Heat map analysis

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图 6 暴露前后吲哚丙烯酸响应比较

Figure 6. Comparison of indoleacrylic acid response before and after exposure

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表 1 样品信息

Table 1. Sample information

样品名称 Name	数量 Quantity	标记 Sample name
对照组	4	D1-D4
暴露组	4	B1-B4

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表 2 质谱条件

Table 2. Mass spectral condition

模式 Ion mode	正离子模式 ESI （+）	负离子模式 ESI （−）
GS1	55	45
GS2	55	45
CUR	35	35
TEM	550	550
ISVF	5500	−4500
DP（MS/MS）	60	−60
CE（MS/MS）	35	−35
CES	15	15

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表 3 流动相洗脱程序

Table 3. Mobile phase elution procedures

时间/min Time	流动相A/% Mobile phase A	流动相B/% Mobile phase B
0	95	5
8	40	60
18	3	97
21	3	97
21.1	95	5
25	95	5

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表 4 差异代谢物

Table 4. Differential metabolites

差异代谢物 Identification		分子式 Formula	贡献度 VIP	偏相关系数 p（corr）	差异倍数 Fold change	P value （T−test）	P value （U−test）
Choline	胆碱	C₅H₁₄NO	3.73	0.52	2.20	0.19	0.34
Enterodiol sulfate	硫酸肠二醇	C₁₈H₂₂O₇S	1.55	0.04	1.08	0.91	1.00
L−Valine*#	L−缬氨酸	C₅H₁₁NO₂	3.74	0.71	6.08	0.05	0.03
Guanidinopropionic acid	胍基丙酸	C₄H₉N₃O₂	2.27	0.54	1.66	0.16	0.20
L−Proline	L−脯氨酸	C₅H₉NO₂	1.63	0.15	1.38	0.73	0.69
L−Tyrosine	L−酪氨酸	C₉H₁₁NO₃	2.32	0.34	2.20	0.42	1.00
L−Isoleucine	异亮氨酸	C₆H₁₃NO₂	2.56	0.25	1.69	0.55	0.34
L−Leucine	L−亮氨酸	C₆H₁₃NO₂	1.88	0.22	1.48	0.59	1.00
L−Phenylalanine	L−苯丙氨酸	C₉H₁₁NO₂	2.21	0.3	1.57	0.47	0.89
Indoleacrylic acid	吲哚丙烯酸	C₁₁H₉NO₂	2.67	0.29	1.56	0.48	1.00
Glycocholic acid	甘氨胆酸	C₂₆H₄₃NO₆	2.5	−0.41	0.70	0.31	0.34
Phytosphingosine	植物鞘氨醇	C₁₈H₃₉NO₃	5.12	0.22	1.17	0.60	1.00
Cholic acid	胆酸	C₂₄H₄₀O₅	1.21	0.26	1.20	0.53	0.69
Undecanoylcholine#	十一烷酰胆碱	C₁₆H₃₄NO₂	2.27	0.67	2.52	0.07	0.03
Chenodeoxyglycocholic acid	乙酰脱氧甘氨胆酸	C₂₆H₄₃NO₅	1.44	−0.31	0.84	0.46	0.89
LysoPC（14:0/0:0）	溶血磷脂酸（14:0）	C₂₂H₄₆NO₇P	2.1	−0.69	0.38	0.06	0.20
LysoPC（16:1/0:0）	溶血磷脂酸（16:1）	C₂₄H₄₈NO₇P	2.44	−0.49	0.52	0.22	0.34
LysoPE（20:3/0:0）	溶血磷脂酸（20:3）	C₂₅H₄₆NO₇P	1.05	−0.67	0.41	0.07	0.20
LysoPE（18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₃H₄₈NO₇P	4.73	−0.65	0.41	0.08	0.20
LysoPC（20:5/0:0）*#	溶血磷脂酸（20:5）	C₂₈H₄₈NO₇P	3.71	−0.83	0.38	0.01	0.03
LysoPC（18:2/0:0）*#	溶血磷脂酸（18:2）	C₂₆H₅₀NO₇P	14.1	−0.83	0.41	0.01	0.03
LysoPC（20:4/0:0）	溶血磷脂酸（20:4）	C₂₈H₅₀NO₇P	2.31	−0.32	0.75	0.44	0.69
LysoPC（14:1/0:0）	溶血磷脂酸（14:1）	C₂₂H₄₄NO₇P	1.10	0.55	11.03	0.16	0.34
LysoPC（22:5/0:0）	溶血磷脂酸（22:5）	C₃₀H₅₂NO₇P	1.17	−0.22	0.85	0.61	0.89
LysoPC（0:0/16:0）	溶血磷脂酸（16:0）	C₂₄H₅₀NO₇P	26.27	−0.53	0.55	0.18	0.49
LysoPC（18:3/0:0）	溶血磷脂酸（18:3）	C₂₆H₄₈NO₇P	5.38	−0.51	0.58	0.20	0.69
LysoPC（20:3/0:0）	溶血磷脂酸（20:3）	C₂₈H₅₂NO₇P	2.99	−0.48	0.73	0.23	0.34
LysoPC（P-16:0/0:0）*#	溶血磷脂酸（16:0）	C₂₄H₅₀NO₆P	7.46	−0.74	0.66	0.03	0.03
LysoPC（18:1/0:0）	溶血磷脂酸（18:1）	C₂₆H₅₂NO₇P	9.09	−0.34	0.66	0.41	0.89
LysoPC（22:4/0:0）	溶血磷脂酸（22:4）	C₃₀H₅₄NO₇P	1.45	0.08	1.05	0.86	1.00
LysoPC（P-18:1/0:0）	溶血磷脂酸（18:1）	C₂₆H₅₂NO₆P	2.38	−0.60	0.75	0.11	0.11
LysoPC（P-18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₆H₅₄NO₆P	1.42	−0.34	0.86	0.41	0.49
LysoPC（20:2/0:0）	溶血磷脂酸（20:2）	C₂₈H₅₄NO₇P	1.39	−0.36	0.74	0.38	0.69
LysoPC（18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₆H₅₄NO₇P	14.11	−0.45	0.69	0.27	0.69
LysoPC（20:0/0:0）*#	溶血磷脂酸（20:0）	C₂₈H₅₈NO₇P	2.51	−0.82	0.52	0.01	0.03
4-Ethylphenylsulfate	4-乙基苯基硫酸盐	C₈H₁₀O₄S	2.19	−0.28	1.20	0.50	0.34
（10E,12Z）-9-HODE	十八碳二烯酸	C₁₈H₃₂O₃	3.40	−0.21	1.53	0.61	0.34
7-HETE	7-羟基花生四烯酸	C₂₀H₃₂O₃	2.23	−0.31	1.81	0.45	1.00
Dodecanoic acid	十二烷酸	C₁₂H₂₄O₂	1.02	−0.51	1.37	0.19	0.34
Eicosapentaenoic acid	二十碳五烯酸	C₂₀H₃₀O₂	2.39	−0.35	1.88	0.39	1.00
Linolenelaidic acid	亚油酸	C₁₈H₃₀O₂	4.10	−0.34	2.83	0.42	0.49
Palmitoleic acid	棕榈酸	C₁₆H₃₀O₂	2.45	−0.46	3.81	0.25	0.69
Arachidonic acid	花生四烯酸	C₂₀H₃₂O₂	7.30	−0.41	2.02	0.31	0.20
Docosapentaenoic acid#	二十二碳五烯酸	C₂₂H₃₄O₂	2.46	−0.54	1.99	0.17	0.03
Linoleic acid	亚油酸	C₁₈H₃₂O₂	10.71	−0.35	1.75	0.39	0.69
Dihomo-alpha-linolenic acid	亚麻脂酸	C₂₀H₃₄O₂	4.31	−0.40	1.51	0.32	0.49
Adrenic acid#	肾上腺酸	C₂₂H₃₆O₂	2.94	−0.53	2.83	0.18	0.03
Palmitic acid*	软脂酸	C₁₆H₃₂O₂	4.69	−0.73	1.45	0.04	0.11
Oleic acid	油酸	C₁₈H₃₄O₂	4.95	−0.41	1.81	0.31	0.49
Hippuric acid*#	马尿酸	C₉H₉NO₃	5.98	0.81	0.40	0.01	0.03
*表示T检验下有显著性差异，#表示Mann-Whitney U检验下有显著性差异

差异代谢物 Identification		分子式 Formula	贡献度 VIP	偏相关系数 p（corr）	差异倍数 Fold change	P value （T−test）	P value （U−test）
Choline	胆碱	C₅H₁₄NO	3.73	0.52	2.20	0.19	0.34
Enterodiol sulfate	硫酸肠二醇	C₁₈H₂₂O₇S	1.55	0.04	1.08	0.91	1.00
L−Valine*#	L−缬氨酸	C₅H₁₁NO₂	3.74	0.71	6.08	0.05	0.03
Guanidinopropionic acid	胍基丙酸	C₄H₉N₃O₂	2.27	0.54	1.66	0.16	0.20
L−Proline	L−脯氨酸	C₅H₉NO₂	1.63	0.15	1.38	0.73	0.69
L−Tyrosine	L−酪氨酸	C₉H₁₁NO₃	2.32	0.34	2.20	0.42	1.00
L−Isoleucine	异亮氨酸	C₆H₁₃NO₂	2.56	0.25	1.69	0.55	0.34
L−Leucine	L−亮氨酸	C₆H₁₃NO₂	1.88	0.22	1.48	0.59	1.00
L−Phenylalanine	L−苯丙氨酸	C₉H₁₁NO₂	2.21	0.3	1.57	0.47	0.89
Indoleacrylic acid	吲哚丙烯酸	C₁₁H₉NO₂	2.67	0.29	1.56	0.48	1.00
Glycocholic acid	甘氨胆酸	C₂₆H₄₃NO₆	2.5	−0.41	0.70	0.31	0.34
Phytosphingosine	植物鞘氨醇	C₁₈H₃₉NO₃	5.12	0.22	1.17	0.60	1.00
Cholic acid	胆酸	C₂₄H₄₀O₅	1.21	0.26	1.20	0.53	0.69
Undecanoylcholine#	十一烷酰胆碱	C₁₆H₃₄NO₂	2.27	0.67	2.52	0.07	0.03
Chenodeoxyglycocholic acid	乙酰脱氧甘氨胆酸	C₂₆H₄₃NO₅	1.44	−0.31	0.84	0.46	0.89
LysoPC（14:0/0:0）	溶血磷脂酸（14:0）	C₂₂H₄₆NO₇P	2.1	−0.69	0.38	0.06	0.20
LysoPC（16:1/0:0）	溶血磷脂酸（16:1）	C₂₄H₄₈NO₇P	2.44	−0.49	0.52	0.22	0.34
LysoPE（20:3/0:0）	溶血磷脂酸（20:3）	C₂₅H₄₆NO₇P	1.05	−0.67	0.41	0.07	0.20
LysoPE（18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₃H₄₈NO₇P	4.73	−0.65	0.41	0.08	0.20
LysoPC（20:5/0:0）*#	溶血磷脂酸（20:5）	C₂₈H₄₈NO₇P	3.71	−0.83	0.38	0.01	0.03
LysoPC（18:2/0:0）*#	溶血磷脂酸（18:2）	C₂₆H₅₀NO₇P	14.1	−0.83	0.41	0.01	0.03
LysoPC（20:4/0:0）	溶血磷脂酸（20:4）	C₂₈H₅₀NO₇P	2.31	−0.32	0.75	0.44	0.69
LysoPC（14:1/0:0）	溶血磷脂酸（14:1）	C₂₂H₄₄NO₇P	1.10	0.55	11.03	0.16	0.34
LysoPC（22:5/0:0）	溶血磷脂酸（22:5）	C₃₀H₅₂NO₇P	1.17	−0.22	0.85	0.61	0.89
LysoPC（0:0/16:0）	溶血磷脂酸（16:0）	C₂₄H₅₀NO₇P	26.27	−0.53	0.55	0.18	0.49
LysoPC（18:3/0:0）	溶血磷脂酸（18:3）	C₂₆H₄₈NO₇P	5.38	−0.51	0.58	0.20	0.69
LysoPC（20:3/0:0）	溶血磷脂酸（20:3）	C₂₈H₅₂NO₇P	2.99	−0.48	0.73	0.23	0.34
LysoPC（P-16:0/0:0）*#	溶血磷脂酸（16:0）	C₂₄H₅₀NO₆P	7.46	−0.74	0.66	0.03	0.03
LysoPC（18:1/0:0）	溶血磷脂酸（18:1）	C₂₆H₅₂NO₇P	9.09	−0.34	0.66	0.41	0.89
LysoPC（22:4/0:0）	溶血磷脂酸（22:4）	C₃₀H₅₄NO₇P	1.45	0.08	1.05	0.86	1.00
LysoPC（P-18:1/0:0）	溶血磷脂酸（18:1）	C₂₆H₅₂NO₆P	2.38	−0.60	0.75	0.11	0.11
LysoPC（P-18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₆H₅₄NO₆P	1.42	−0.34	0.86	0.41	0.49
LysoPC（20:2/0:0）	溶血磷脂酸（20:2）	C₂₈H₅₄NO₇P	1.39	−0.36	0.74	0.38	0.69
LysoPC（18:0/0:0）	溶血磷脂酸（18:0）	C₂₆H₅₄NO₇P	14.11	−0.45	0.69	0.27	0.69
LysoPC（20:0/0:0）*#	溶血磷脂酸（20:0）	C₂₈H₅₈NO₇P	2.51	−0.82	0.52	0.01	0.03
4-Ethylphenylsulfate	4-乙基苯基硫酸盐	C₈H₁₀O₄S	2.19	−0.28	1.20	0.50	0.34
（10E,12Z）-9-HODE	十八碳二烯酸	C₁₈H₃₂O₃	3.40	−0.21	1.53	0.61	0.34
7-HETE	7-羟基花生四烯酸	C₂₀H₃₂O₃	2.23	−0.31	1.81	0.45	1.00
Dodecanoic acid	十二烷酸	C₁₂H₂₄O₂	1.02	−0.51	1.37	0.19	0.34
Eicosapentaenoic acid	二十碳五烯酸	C₂₀H₃₀O₂	2.39	−0.35	1.88	0.39	1.00
Linolenelaidic acid	亚油酸	C₁₈H₃₀O₂	4.10	−0.34	2.83	0.42	0.49
Palmitoleic acid	棕榈酸	C₁₆H₃₀O₂	2.45	−0.46	3.81	0.25	0.69
Arachidonic acid	花生四烯酸	C₂₀H₃₂O₂	7.30	−0.41	2.02	0.31	0.20
Docosapentaenoic acid#	二十二碳五烯酸	C₂₂H₃₄O₂	2.46	−0.54	1.99	0.17	0.03
Linoleic acid	亚油酸	C₁₈H₃₂O₂	10.71	−0.35	1.75	0.39	0.69
Dihomo-alpha-linolenic acid	亚麻脂酸	C₂₀H₃₄O₂	4.31	−0.40	1.51	0.32	0.49
Adrenic acid#	肾上腺酸	C₂₂H₃₆O₂	2.94	−0.53	2.83	0.18	0.03
Palmitic acid*	软脂酸	C₁₆H₃₂O₂	4.69	−0.73	1.45	0.04	0.11
Oleic acid	油酸	C₁₈H₃₄O₂	4.95	−0.41	1.81	0.31	0.49
Hippuric acid*#	马尿酸	C₉H₉NO₃	5.98	0.81	0.40	0.01	0.03
*表示T检验下有显著性差异，#表示Mann-Whitney U检验下有显著性差异

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表 5 代谢通路信息

Table 5. Metabolic pathway information

通路名称 Pathways	相关代谢物 Metabolites	P值 -lg10（p）	影响 Impact
Aminoacyl-tRNA biosynthesis	L-Phenyl`alanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline	4.19	0.00
Biosynthesis of unsaturated fatty acids	Hexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid	3.75	0.00
Valine, leucine and isoleucine biosynthesis	L-Leucine; L-Isoleucine; L-Valine	3.73	0.00
Phenylalanine metabolism	L-Phenylalanine; Hippurate; L-Tyrosine;	3.15	0.36
Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis	L-Phenylalanine; L-Tyrosine;	2.85	1.00
Valine, leucine and isoleucine degradation	L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine	1.63	0.00
Linoleic acid metabolism	Linoleate	1.11	1.00
Glycerophospholipid metabolism	1-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Choline	0.96	0.04
Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis	L-Tyrosine	0.87	0.00
Primary bile acid biosynthesis	Cholic acid; Glycocholate	0.79	0.02
Fatty acid biosynthesis	Hexadecanoic acid; Dodecanoic acid	0.77	0.01
Pantothenate and CoA biosynthesis	L-Valine	0.58	0.00
Sphingolipid metabolism	Phytosphingosine	0.54	0.00
Glycine, serine and threonine metabolism	Choline	0.37	0.00
Arachidonic acid metabolism	Arachidonate	0.35	0.32
Arginine and proline metabolism	L-Proline	0.34	0.08
Fatty acid elongation	Hexadecanoic acid	0.33	0.00
Fatty acid degradation	Hexadecanoic acid	0.33	0.00
Tyrosine metabolism	L-Tyrosine	0.31	0.14
Aminoacyl-tRNA biosynthesis	L-Phenylalanine; L-Valine; L-Isoleucine; L-Leucine; L-Tyrosine; L-Proline	4.19	0.00
Biosynthesis of unsaturated fatty acids	Hexadecanoic acid; （9Z）-Octadecenoic acid; Linoleate; Arachidonate; （5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）-Icosapentaenoic acid	3.75	0.00

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多氯代二苯并-对-二恶英和多氯代二苯并呋喃（PCDD/Fs）是传统的持久性有机污染物（POPs），具有POPs典型的持久性、高毒性、长距离迁移性和生物累积性的特征^[1]，能给动物和人类带来严重的健康风险。随着全球工业的快速发展，PCDD/Fs排放源的数量不停增长密度持续增大，农产品也不可避免的受到了影响^[2]。从20世纪末到21世纪，PCDD/Fs污染畜禽饲料及农产品等的污染事件频繁发生^[2-3]。华北某地区是著名的“钢都”同时也是全国第二大的“奶都”。钢铁厂是PCDD/Fs污染的典型来源，钢铁厂坐落在农田附近又紧挨奶牛养殖场，农田中农作物的生产不可避免的会受到影响。而相当部分的农作物会作为畜禽动物的饲料原料直接进行回收加工，使得PCDD/Fs沿着食物链进行传递。目前关于PCDD/Fs的研究主要集中在环境污染调查和致毒效应探究^[4]。并且国际上关于奶牛这种大型哺乳动物的污染物暴露实验极少，多数实验采用纯品添加进饲料进行暴露，无法还原实际污染条件，可能存在夸大PCDD/Fs暴露风险的问题。

代谢组学是研究生物内源性小分子代谢物整体及其变化规律的学科，以高通量、高灵敏度著称^[5]，是继基因组学和蛋白组学新发展起来的学科。近年来代谢组学的发展为毒理学的深入研究提供了新的技术手段和思路。可以通过检测代谢通路上多种代谢物的变化来探究代谢紊乱背后的机制，评价环境污染物暴露所带来的毒性效应^[6]，进而推断毒性作用的分子机制，具有快速和高灵敏度等特点。血液作为机体的重要媒介体液，包含了不同组织器官的多种代谢产物^[7]。Tian等^[8]采用血液代谢组学检测与奶牛热应激有关的生物标志物，共鉴定出41种代谢产物。迄今为止对奶牛血液代谢物的研究主要是对血液中葡萄糖、胆固醇、游离脂肪酸等常规参数的测定，很少有研究探究污染物对奶牛整体代谢的影响。

本研究通过在饲料中添加飞灰暴露奶牛，探究其对奶牛血液代谢组的影响，筛选差异代谢物，揭示PCDD/Fs暴露的健康效应和在奶牛体内的迁移代谢规律，寻找潜在的生物标志物。

1. 材料与方法（Materials and methods）

1.1. 动物喂养实验及采样

场地设置在一个集中式的奶牛养殖场，选择体重约为600 kg，二胎次的荷斯坦奶牛4头进行暴露，洁净饲料饲喂奶牛为对照。由于更换养殖场地可能会导致奶牛出现严重应激反应，影响奶牛食欲和产奶量。因此适应期阶段使用洁净饲料进行饲喂，让奶牛适应环境后开始实验。将飞灰作为PCDD/Fs的载体，每日将30 g飞灰与40 kg洁净饲料充分混匀，暴露量为0.61 pgTEQ·g⁻¹，连续饲喂38 d。于第38天采集血液，离心，收集上层血清，置于−80 ℃冰箱保存，样品信息见表1。

1.2. 样品前处理

样品解冻后，取适量血清（200 μL），加3倍量乙腈（600 μL），涡旋2 min，13000 r·min⁻¹离心10 min，取上清400 μL，氮气吹干。吹干样品后用100 μL 50%乙腈复溶，涡旋60 s，离心10 min（13000 r·min⁻¹ ，4 ℃）。吸取上清2 μL进样。另取所有样品适量，等量混合，为QC样品。检测过程中每4个样品插入一针QC，用于监测仪器与方法的稳定性。

1.3. LC-MS分析

采用SCIEX Exion LC 联合 X-500R Q-TOF mass spectrometer （AB Sciex, Foster City, CA, USA）液质联用仪按表2中参数进行分析，电喷雾离子源ESI，正负离子扫描模式，扫描范围m/z100-1250。

所使用色谱柱为Waters Acquity BEH C18 column （2.1 mm×100 mm, 1.7 μm），洗脱程序如表3所示。柱温为35 ℃，流动相为A：水（含0.1%甲酸）；B：乙腈；流速：0.3 mL·min⁻¹；进样体积：2 μL。

1.4. 数据分析及统计分析

通过SCIEX OS Analytics提取原始图谱并进行数据矩阵的转换，主要包括质荷比（m/z）和保留时间（Rt）及峰面积（intensity）等信息。所有数据用总峰面积进行归一化后生成的excel表用于代谢组学分析。为减少偶然误差产生的信号干扰，对QC中RSD≥40%的变量先行在excel中剔除。将excel文件导入SIMCA 14.1软件中进行多元数理统计分析。

3. 结论（Conclusion）

综上所述，本实验采用代谢组学技术研究了饲喂奶牛含PCDD/Fs的饲料血液代谢组学变化情况，发现PCDD/Fs暴露导致奶牛的脂肪酸代谢、氨基酸代谢、糖代谢均受到影响，从代谢层面揭示了PCDD/Fs的潜在健康风险。本研究共鉴定50个差异代谢物，其中包含AhR内源性配体，为探究PCDD/Fs暴露的健康风险生物标志物提供了重要依据。

参考文献 (32)

二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn;

Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs

Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ;

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二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn;

English Abstract

Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs

Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ;

全文HTML

1.1. 动物喂养实验及采样

1.2. 样品前处理

1.3. LC-MS分析

1.4. 数据分析及统计分析

2.1. 血液样本代谢谱分析

2.2. 多元统计学分析

2.3. 差异代谢物的筛选

2.4. 生物信息学分析和生物标记物筛选

目录

二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn;

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Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ;

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出版历程

二恶英暴露下奶牛血液代谢组学研究

通讯作者: Tel：010-62842865，E-mail：lixu@rcees.ac.cn;

English Abstract

Metabolomics study on blood of cow exposed to PCDD/Fs

Corresponding author: XU Li, lixu@rcees.ac.cn ;

全文HTML

1.1. 动物喂养实验及采样

1.2. 样品前处理

1.3. LC-MS分析

1.4. 数据分析及统计分析

2.1. 血液样本代谢谱分析

2.2. 多元统计学分析

2.3. 差异代谢物的筛选

2.4. 生物信息学分析和生物标记物筛选

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