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两种除草剂与两种杀虫剂对蛋白核小球藻的联合毒性作用评估

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马添翼, 张瑾, 周娜娜, 宋崇崇. 两种除草剂与两种杀虫剂对蛋白核小球藻的联合毒性作用评估[J]. 环境化学, 2022, 41(7): 2221-2233. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022012806
引用本文: 马添翼, 张瑾, 周娜娜, 宋崇崇. 两种除草剂与两种杀虫剂对蛋白核小球藻的联合毒性作用评估[J]. 环境化学, 2022, 41(7): 2221-2233. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022012806
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MA Tianyi, ZHANG Jin, ZHOU Nana, SONG Chongchong. Evaluation of joint toxicity of two herbicides and two insecticides on Chlorella pyrenoidosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(7): 2221-2233. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022012806
Citation: MA Tianyi, ZHANG Jin, ZHOU Nana, SONG Chongchong. Evaluation of joint toxicity of two herbicides and two insecticides on Chlorella pyrenoidosa[J]. Environmental Chemistry, 2022, 41(7): 2221-2233. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2022012806
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两种除草剂与两种杀虫剂对蛋白核小球藻的联合毒性作用评估

  • 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥，230601

    • 通讯作者: Tel：18019580589，E-mail：ginnzy@163.com; 
  • 基金项目:
    国家自然科学基金(21677001)，国家重点研发项目(2019YFC0408503)和大学生科技创新项目(202110878023)资助.

Evaluation of joint toxicity of two herbicides and two insecticides on Chlorella pyrenoidosa

  • Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei ，230601, China

    • Corresponding author: ZHANG Jin, ginnzy@163.com ; 
  • Fund Project: The National Natural Science Foundation of China (21677001), the Project of National Key Research and Development Program (2019YFC0408503) and Student Science and Technology Innovation Project (202110878023).

  • 摘要: 为探讨两类典型农药(除草剂与杀虫剂)对水生生物的联合毒性效应，以两种除草剂：氰草津(cyanazine, CYA)、敌草快(diquat, DIQ)和两种杀虫剂：敌百虫(dipterex, DIP)、杀线威(oxamyl, OXA)为研究对象，采用直接均分射线法(direct equipartition ray, EquRay)设计4组二元除草剂-杀虫剂混合物体系，应用时间毒性微板分析法(Time-dependent microplate toxicity analysis, t-MTA)系统研究目标化合物及其二元混合物体系对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)在不同暴露时间(12、24、28、72、96 h)的毒性效应，分别应用浓度加和(concentration addition, CA)模型、绝对残差(deviation from CA, dCA)模型和拓展等效线图法分析除草剂和杀虫剂对C. pyrenoidosa的联合毒性作用。结果表明，4种农药的毒性由强到弱依次为CYA>DIQ>OXA>DIP，且两种除草剂在48—96 h的半数效应浓度(EC50)值均比两种杀虫剂的EC50值高出1—2个数量级；3种模型对混合物的毒性作用评估基本一致，除草剂与杀虫剂二元混合物OXA-CYA、OXA-DIQ、DIP-CYA的毒性作用整体上呈现由加和作用向拮抗作用转变，DIP-DIQ则呈现由加和作用向较弱的协同作用转变，且各混合物体系的毒性作用都具有时间依赖性和浓度比依赖性；3个模型各有优缺点， CA是最经典的模型，可以直观地描述所有混合物毒性作用的动态变化规律，dCA模型可以定量描述混合物毒性作用的强度，拓展等效线图可以直观的描述两元混合物各组分间相互作用的浓度比依赖关系。
    Abstract: In order to explore the joint toxic effects of two typical pesticides (herbicide and insecticide) on aquatic organisms, two herbicides: cyanazine (CYA), diquat (DIQ) and two insecticides: dipterex (DIP) and oxamyl (OXA) were used as research objects, and the direct equipartition ray (EquRay) was used to design four groups of binary herbicide-insecticide mixture systems. The time-dependent microplate toxicity analysis (t-MTA) was used to study the effects of target compounds and binary mixture systems on Chlorella pyrenoidosa (C. pyrenoidosa) at different exposure times (12, 24, 28, 72 and 96 h). Concentration addition (CA) model, deviation from CA (dCA) model and extended isobologram method were used to analyze the joint toxic effects of herbicides and insecticides on C. pyrenoidosa. The results showed that the order of toxicity of four pesticides was CYA>DIQ>OXA>DIP, and the median effect concentration (EC50) values of the two herbicides were 1—2 orders of magnitude higher than those of the two insecticides at 48—96 h. The toxicity interaction of mixtures evaluated by the three models was basically consistent. The combined toxicity of herbicide and pesticide binary mixtures OXA-CYA, OXA-DIQ and DIP-CYA showed a transformation from additive effect to antagonistic effect on the whole, while DIP-DIQ showed a transformation from additive effect to weak synergistic effect. The combined toxicity of each mixture system was time-dependent and concentration-ratio dependent. The three models have their own advantages and disadvantages. CA is the most classical model, which can intuitively describe the dynamic change rules of toxic effects of all mixtures, dCA model can quantitatively describe the toxicity interaction intensity of all mixtures, and the extended isobologram can more intuitively describe the concentration-ratio dependence of toxicity interaction between components of binary mixtures.
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  • 图 1  4种农药在不同暴露时间内的pEC50值雷达图

    Figure 1.  Radar graphs of pEC50 values of four pesticides in different exposure time

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    图 2  4种农药对C. pyrenoidosa的时间-浓度-效应曲线

    Figure 2.  The time-concentration-response curve of four pesticides on C. pyrenoidosa

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    图 3  农药二元混合物OXA-CYA对C. pyrenoidosa的CA预测与实测CRC

    Figure 3.  The predicted line by CA and measured CRC for the binary mixture systems of pesticides OXA-CYA on C. pytenoidosa

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    图 4  农药二元混合物OXA-DIQ和DIP-CYA对C. pyrenoidosa的CA预测与实测CRC

    Figure 4.  The predicted line by CA and measured CRC for the binary mixture systems of pesticides OXA-DIQ and DIP-CYA on C. pytenoidosa

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    图 5  农药二元混合物DIP-DIQ对C. pyrenoidosa的CA预测与实测CRC

    Figure 5.  The predicted line by CA and measured CRC for the binary mixture systems of pesticides DIP-DIQ on C. pytenoidosa

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    图 6  4组二元混合物体系对C. pyrenoidosa的绝对残差(dCA)值图

    Figure 6.  The dCA value graphs for four groups of binary mixture systems on C. pytenoidosa

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    图 7  4组农药二元混合物在5个不同效应水平(EC30，EC40，EC50，EC60和EC70)的拓展等效线图

    Figure 7.  Extended isobolograms at five effect concentration levels (EC30, EC40, EC50, EC60 and EC70) for four binary mixtures of pesticides

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    表 1  4种农药的化学结构式及基本理化性质

    Table 1.  Chemical structural formula and basic physical and chemical properties of four pesticides

    农药
    Pesticides    		简称Abbreviation化学结构
    Chemical structures    		分子式
    Molecular formula    		CAS分子量/(g·mol−1)
    Molecular weight    		纯度/％
    Purity
    敌草快
    Diquat    		DIQC12H12Br2N22764-72-9344.05≥97.0
    氰草津
    Cyanazine    		CYAC9H13ClN621725-46-2240.69≥97.0
    敌百虫
    Dipterex    		DIPC4H8Cl3O4P52-68-6257.44≥99.0
    杀线威
    Oxamyl    		OXAC7H13N3O3S23135-22-0219.29≥99.0
    农药
    Pesticides    		简称Abbreviation化学结构
    Chemical structures    		分子式
    Molecular formula    		CAS分子量/(g·mol−1)
    Molecular weight    		纯度/％
    Purity
    敌草快
    Diquat    		DIQC12H12Br2N22764-72-9344.05≥97.0
    氰草津
    Cyanazine    		CYAC9H13ClN621725-46-2240.69≥97.0
    敌百虫
    Dipterex    		DIPC4H8Cl3O4P52-68-6257.44≥99.0
    杀线威
    Oxamyl    		OXAC7H13N3O3S23135-22-0219.29≥99.0
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    表 2  农药二元混合物体系的组分构成及其浓度比(pi)

    Table 2.  The component and its concentration ratios (pi) for the binary mixture systems of pesticides

    RaypOXApCYARaypOXApDIQ
    R19.89×10−11.10×10−2R19.65×10−13.52×10−2
    R29.73×10−12.70×10−2R29.16×10−18.36×10−2
    R39.47×10−15.26×10−2R38.46×10−11.54×10−1
    R49.00×10−19.99×10−2R47.33×10−12.67×10−1
    R57.83×10−12.17×10−1R55.23×10−14.77×10−1
    RaypDIPpCYARaypDIPpDIQ
    R19.99×10−11.04×10−3R19.97×10−13.42×10−3
    R29.97×10−12.61×10−3R29.92×10−18.52×10−3
    R39.95×10−15.20×10−3R39.83×10−11.69×10−2
    R49.90×10−11.04×10−2R49.67×10−13.32×10−2
    R59.75×10−12.55×10−2R59.21×10−17.91×10−2
    RaypOXApCYARaypOXApDIQ
    R19.89×10−11.10×10−2R19.65×10−13.52×10−2
    R29.73×10−12.70×10−2R29.16×10−18.36×10−2
    R39.47×10−15.26×10−2R38.46×10−11.54×10−1
    R49.00×10−19.99×10−2R47.33×10−12.67×10−1
    R57.83×10−12.17×10−1R55.23×10−14.77×10−1
    RaypDIPpCYARaypDIPpDIQ
    R19.99×10−11.04×10−3R19.97×10−13.42×10−3
    R29.97×10−12.61×10−3R29.92×10−18.52×10−3
    R39.95×10−15.20×10−3R39.83×10−11.69×10−2
    R49.90×10−11.04×10−2R49.67×10−13.32×10−2
    R59.75×10−12.55×10−2R59.21×10−17.91×10−2
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    表 3  4种农药的Weibull函数拟合结果及其统计量

    Table 3.  Weibull function fitting results and statistics for the four pesticides

    Name时间/h
    Time    		αβRMSEREC50/(mol·L−1)pEC50
    OXA121.840.820.0550.8739∞0
    241.170.620.0630.8094∞0
    483.650.990.1070.90368.77×10−54.06
    725.851.410.1010.95063.90×10−54.41
    9610.142.350.0800.98443.38×10−54.47
    DIP122.511.300.0270.9641∞0
    242.521.230.0280.9710∞0
    484.431.510.0640.96606.66×10−43.18
    726.502.040.0830.96544.31×10−43.37
    9610.143.050.0840.97803.59×10−43.45
    DIQ124.511.260.0310.9665∞0
    244.091.150.0210.9823∞0
    484.380.990.0580.96301.61×10−54.80
    725.281.110.0640.96948.19×10−65.09
    966.251.270.0730.96906.17×10−65.21
    CYA122.530.680.0450.9272∞0
    242.630.710.0520.9079∞0
    483.920.790.0810.92133.75×10−65.43
    725.381.020.0920.93772.32×10−65.63
    966.621.220.0920.95111.88×10−65.73
    Name时间/h
    Time    		αβRMSEREC50/(mol·L−1)pEC50
    OXA121.840.820.0550.8739∞0
    241.170.620.0630.8094∞0
    483.650.990.1070.90368.77×10−54.06
    725.851.410.1010.95063.90×10−54.41
    9610.142.350.0800.98443.38×10−54.47
    DIP122.511.300.0270.9641∞0
    242.521.230.0280.9710∞0
    484.431.510.0640.96606.66×10−43.18
    726.502.040.0830.96544.31×10−43.37
    9610.143.050.0840.97803.59×10−43.45
    DIQ124.511.260.0310.9665∞0
    244.091.150.0210.9823∞0
    484.380.990.0580.96301.61×10−54.80
    725.281.110.0640.96948.19×10−65.09
    966.251.270.0730.96906.17×10−65.21
    CYA122.530.680.0450.9272∞0
    242.630.710.0520.9079∞0
    483.920.790.0810.92133.75×10−65.43
    725.381.020.0920.93772.32×10−65.63
    966.621.220.0920.95111.88×10−65.73
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-01-28
  • 录用日期:  2022-05-06
  • 刊出日期:  2022-07-27

两种除草剂与两种杀虫剂对蛋白核小球藻的联合毒性作用评估

    通讯作者: Tel：18019580589，E-mail：ginnzy@163.com; 
  • 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥，230601
  • 收稿日期:  2022-01-28
  • 录用日期:  2022-05-06
  • 网络出版日期:  2022-07-12
基金项目:
国家自然科学基金(21677001)，国家重点研发项目(2019YFC0408503)和大学生科技创新项目(202110878023)资助.

摘要: 为探讨两类典型农药(除草剂与杀虫剂)对水生生物的联合毒性效应，以两种除草剂：氰草津(cyanazine, CYA)、敌草快(diquat, DIQ)和两种杀虫剂：敌百虫(dipterex, DIP)、杀线威(oxamyl, OXA)为研究对象，采用直接均分射线法(direct equipartition ray, EquRay)设计4组二元除草剂-杀虫剂混合物体系，应用时间毒性微板分析法(Time-dependent microplate toxicity analysis, t-MTA)系统研究目标化合物及其二元混合物体系对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)在不同暴露时间(12、24、28、72、96 h)的毒性效应，分别应用浓度加和(concentration addition, CA)模型、绝对残差(deviation from CA, dCA)模型和拓展等效线图法分析除草剂和杀虫剂对C. pyrenoidosa的联合毒性作用。结果表明，4种农药的毒性由强到弱依次为CYA>DIQ>OXA>DIP，且两种除草剂在48—96 h的半数效应浓度(EC50)值均比两种杀虫剂的EC50值高出1—2个数量级；3种模型对混合物的毒性作用评估基本一致，除草剂与杀虫剂二元混合物OXA-CYA、OXA-DIQ、DIP-CYA的毒性作用整体上呈现由加和作用向拮抗作用转变，DIP-DIQ则呈现由加和作用向较弱的协同作用转变，且各混合物体系的毒性作用都具有时间依赖性和浓度比依赖性；3个模型各有优缺点， CA是最经典的模型，可以直观地描述所有混合物毒性作用的动态变化规律，dCA模型可以定量描述混合物毒性作用的强度，拓展等效线图可以直观的描述两元混合物各组分间相互作用的浓度比依赖关系。

English Abstract

    全文HTML

  • 我国的耕地总面积位居世界前列，但人均耕地面积却远远落后于世界平均水平。为了确保粮食安全，农药被大量用来预防和减轻虫病草害，这些农药大部分流入环境并造成了较严重的污染问题[1]。有研究表明，有机磷农药的实际利用率仅为10%—20%，残留农药通过自然循环等途径流入土壤和水体中[2]。这些农药污染物随着时间不断富集，并借助农产品、饮用水等介质威胁着我们的食品安全和环境安全[3-4]。如Liu等[5]在我国的部分农产品和种植土壤样品中发现，36.4%的柿子样品和70.8%的枣样品中存在有机磷类、拟除虫菊酯类等多种农药化合物的残留成分。孙悦等[6]在51个不同产地的中药材三七样品中均检测出不同程度的农药残留，且有机磷类、有机氯类农药残留量对人体存在一定的健康风险。为了应对愈发严峻的农药残留对环境产生的污染问题，我国及日本等国已经将诸如甲胺磷、对硫磷、马拉硫磷、乙基对硫磷等具有急性神经毒性作用的农药列入禁用名单[7-8]。越来越多的研究表明，农药减量控害方面的研究对人类和环境健康具有愈发重要的意义[9]。

    据统计，2019年全球农药市场中，除草剂和杀虫剂分别以40%和30%的占比位列前二[10]。在这两类典型的农药中，敌草快与氰草津是两种以化学结构分类具有代表性的除草剂，杀线威和敌百虫也因其药效好、用途多，在杀虫剂中使用范围广泛[11]。并且，上述4种农药都具有很高的水溶性，极易对水环境产生污染，因此有必要开展其对水生生物的毒性研究[12]。目前大部分学者对农药残留的毒性研究都停留在单一污染物层面[13-14]，考虑到除草剂与杀虫剂在实际环境中常以混合污染物的形式存在，这些污染物对生物产生联合毒性作用时，其作用方式往往与单一污染物不同[15-16]。因此对除草剂与杀虫剂的混合物进行联合毒性方面的研究具有一定的现实意义[16]。

    蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)是一种属于绿藻门的单细胞藻类。因其具有易培养、繁殖快以及呈游离分布与污染物接触充分等优点，是一种理想的污染物毒性实验的指示生物[17]。如王滔等[18]以C. pyrenoidosa为受试生物考察了三嗪类农药对水生生物的毒性作用，Li等[19]以C. pyrenoidosa为受试生物评估了矿区污染物对水生态系统初级生产者的环境风险。

    本文选择环境中存在的两类典型农药(除草剂与杀虫剂)污染物为研究对象，以C. pyrenoidosa为受试生物，合理地设计这两类农药的二元混合物射线，应用时间依赖微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis, t-MTA)测定农药及其混合物对C. pyrenoidosa的毒性结果，并应用经典加和模型浓度加和(concentration addition, CA)、绝对残差(deviation from CA, dCA)模型与拓展等效线图法分析不同混合物体系的联合毒性关系，为农药混合污染物的毒性评估和生态风险评估提供借鉴，同时也可以横向对比评估3种方法各自的优缺点，为混合物毒性的评估方法选择提供参考。

    • 1.   材料与方法（Materials and methods）

      1.1.   试剂与仪器

    • 本实验所涉及的农药目标污染物共4种，其中除草剂2种为敌草快 (diquat, DIQ)和氰草津 (cyanazine, CYA)，杀虫剂2种为敌百虫 (dipterex, DIP)和杀线威 (oxamyl, OXA)。所有农药标准品均购自上海原叶生物科技有限公司，储备液均使用超纯水配制于棕色瓶中于4 ℃冰箱保存，所用试剂的化学结构式及理化性质如表1所示。

      主要试验仪器有：Synery-2酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、MGC-250光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、ESJ182-4万分之一电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)、Genex系列移液器(宝予德(中国)有限公司)等[20]。

      • 1.2.   藻种培养、时间毒性测试与计算

    • 实验所用蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，采用BG11培养基，培养基的配制和藻培养过程参见文献[21]。

      实验采用透明的96孔微板作为实验载体，所用微板毒性分析方法参见文献[20]。将实验所用微板置于温度(25±1) ℃、光强5000 lux、光暗比14 h∶10 h的光照培养箱中培养，分别在不同暴露时间(12、24、48、72、96 h)用酶标仪测定683 nm波长下的吸光度，以农药对C. pyrenoidosa的生长速率的抑制率E为毒性指标，计算不同暴露时间下单一或二元混合污染物的毒性数据。E的计算公式如下：

      式中，OD0为空白组的C. pyrenoidosa吸光度；OD为实验组的C. pyrenoidosa吸光度。

      • 1.3.   浓度-效应数据拟合

    • 本实验所涉及单一和二元混合污染物在不同暴露时间下的浓度-效应数据经处理后均采用两参数Weibull函数进行非线性拟合[22]，得到拟合参数α、β。具体函数公式表示如下：

      式中，E表示抑制率(0<E<1)；α表示位置参数，β表示斜率或形状参数；c表示农药或混合物的浓度，mol·L−1。

      浓度-效应曲线(concentration-response curve, CRC)的实验误差采用CRC的95%观测置信区间(Observation-based confidence interval, OCI)来进行评估[23]。

      • 1.4.   混合物设计

    • 混合物的整体毒性是由混合物中各组分的毒性以及各组分之间的联合毒性共同作用决定的。本文在进行二元混合物设计时采用的方法为直接均分射线法(direct equipartition ray, EquRay)[24] ，该方法可以全面且有效的实现二元混合物的组分浓度比设计[25]。本文将两种目标除草剂分别与两组目标杀虫剂构建二元混合物体系，4组体系下的各条混合物射线的组分及其浓度配比(pi)值列于表2。

      • 1.5.   混合物的毒性作用分析

    • 浓度加和(concentration addition, CA)模型是一种经典的污染物联合毒性分析的参考模型，依据混合物毒性与单个组分毒性之间的关系来判断混合物各组分之间是否具有毒性相互作用。通常当CA模型计算得到混合物的预测线在实验观测值95%OCI以内时，该混合物呈现加和作用；当CA预测线在95%OCI以上时，混合物呈现拮抗作用；当CA预测线在95%OCI以下时，我们认为该混合物呈现协同作用[22]。CA模型数学表达式如下：

      式中，Ci表示混合物产生x%效应时第i组分的浓度，mol·L−1；ECx，i表示混合物中第i个组分单独作用时产生x%效应时的浓度，mol·L−1。

      绝对残差(deviation from CA, dCA)模型可以反映CA预测值与实验观测值之间的绝对偏差，当dCA=0时，说明混合物体系为加和作用；当dCA<0时，说明混合物体系为协同作用；当dCA>0时，说明混合物体系为拮抗作用。dCA模型数学表达式如下：

      式中，EPRD为CA预测值，EOBS为实验观测值。

      等效线图法是另一种经典的污染物联合毒性分析方法，但存在只能评估单一效应水平下的污染物联合毒性的不足。拓展等效线图在此基础上增加了不同效应水平下污染物联合毒性的评估，更加全面的考察混合物从低到高多个效应水平下的联合毒性[26]。拓展等效线图法是通过连接直角坐标系中二元混合物各组分的效应浓度值点，构造截距即CA预测线。再将实验得到的数据拟合成等效线并与CA预测线的位置进行比较，CA预测线的上方区域对应拮抗作用区域，而下方区域表示协同作用区域，偏离程度则表示联合毒性作用强弱。

    2.   结果与讨论(Results and discussion)

      2.1.   单一农药对C. pyrenoidosa在不同暴露时间的毒性变化规律

    • 4种农药对C. pyrenoidosa的时间-浓度-效应数据的拟合参数值、统计分析结果RMSE值(均方根误差)和R值(相关系数)见表3。

      由表3可以看出，Weibull函数对于4种农药在暴露时间72、96 h下的浓度-效应数据拟合结果都较好(R>0.95, RMSE<0.1)。但对于OXA和CYA两种农药在暴露时间12、24、48 h的数据拟合结果一般，其原因可能是初期农药对C. pyrenoidosa毒性较小，或是初期C. pyrenoidosa的生长过程还处于适应期。两种除草剂在48—96 h的半数效应浓度(median effect concentration, EC50)均比两种杀虫剂的EC50值高出1—2个数量级。为更加形象表征4种农药对C. pyrenoidosa在不同暴露时间的毒性变化规律，以半数效应浓度的负对数(negative logarithm of half effect concentration, pEC50)为毒性指标绘制不同暴露时间(48 h—96 h)下的雷达图如图1所示。

      由图1可以看出，4种农药的毒性均随时间的延长而增加，同一暴露时间下不同农药对C. pyrenoidosa的毒性大小也有所不同。例如暴露时间96 h下4种农药的毒性(pEC50)由大到小依次为：CYA(5.73)>DIQ(5.21)>OXA(4.47)>DIP(3.45)，且随着暴露时间的增加毒性均呈现单调升高的规律。

      4种农药对C. pyrenoidosa在5个时间节点下的CRC曲线如图2所示。从图2可以看出，4种农药对C. pyrenoidosa单独作用时，两种杀虫剂的抑制率随时间和浓度的变化规律与其它农药相比有一定区别。各个暴露时间下DIP的低浓度区域对C. pyrenoidosa的抑制率都非常低，而在中、高浓度区域的抑制率则有非常明显的增加，且在某个浓度附近急剧增加。OXA单独作用于C. pyrenoidosa时在低浓度区域的抑制率随暴露时间延长先增加后降低，在中、高浓度区域的抑制率，随暴露时间延长而增加。2种除草剂DIQ和CYA的抑制率变化规律一致，抑制率随着浓度的增大和暴露时间的延长而逐渐增加.

      • 2.2.   基于CA模型评价农药二元混合物在不同暴露时间的联合毒性作用

    • 基于CA模型对4组农药二元混合物在不同暴露时间下的联合毒性进行了评估，二元混合物体系OXA-CYA的CA预测与实测CRC图如图3所示。在同一时间点下OXA-CYA体系从R1到R5射线的CA预测线与实验观测值拟合线之间的偏离程度在不断变大，且都落在拟合线的上方，这表明其组分间的拮抗作用是逐渐增强的。从表2中可知，OXA-CYA体系从R1到R5，CYA所占浓度比逐渐增大，这反映出该体系的拮抗作用强弱可能与CYA的浓度比有关[27-28]。OXA-CYA体系从R1到R3的射线在前72 h下的CA预测线均落在95%OCI内，联合毒性表现为加和作用，随着暴露时间的增长，混合物的各条射线的联合毒性表现逐渐从加和作用转变为拮抗作用。而R4、R5两条射线从12 h开始CA预测线就落在95%OCI的上方，且随着暴露时间的增加中高浓度区域的CA预测线与95%OCI之间的距离逐渐变大，表现出较强的拮抗作用。不难发现，OXA-CYA体系的联合毒性关系与各组分的浓度比和暴露时间密切相关。

      二元混合物体系OXA-DIQ和DIP-CYA前24小时的毒性作用类型整体表现为加和作用，48—96 h的CA预测与实测CRC图如图4所示。两组体系下各条射线随着时间的增加都呈现出CA预测线均落在实验观测点拟合线上方的规律，且在偏离95%OCI后随着时间的增加偏离程度愈发明显。这表明，两组体系中组分间的联合毒性表现为拮抗作用并有着相似的时间依赖性。此外，这两组体系都在R3射线表现出最强的拮抗作用，R2和R4射线次之，R1和R5射线最弱。结合表2中两组体系各组分的浓度配比，推测OXA-DIQ和DIP-CYA体系与OXA-CYA体系中CYA占主导作用不同，这两组体系组分间的拮抗作用在其组分浓度配比为某一比例时达到最强。

      影响混合物组分之间联合毒性的因素与各组分浓度和暴露时间等相关[29]。出现拮抗作用可能是由于该组混合物中，起决定作用的组分在对蛋白核小球藻致毒过程中出现了不同的毒性效应或者类似竞争作用位点的可结合性的下降，从而减弱了双方的毒性[30]。

      图5为二元混合物体系DIP-DIQ暴露时间48—96 h的CA预测与实测CRC图。可以看出该体系下5条射线的CA预测线虽然都在95%OCI内即表现为加和作用，但随着暴露时间的增加CA预测逐渐向下偏离实验观测点拟合线，且R5射线在96 h下的CA预测线几乎与95%OCI的下置信区间线重合。若不考虑置信区间，我们可以认为该体系的联合毒性存在较弱的协同作用，这也与下文中dCA模型和拓展等效线图得出的结论相同。

      • 2.3.   基于dCA模型评价农药二元混合物在不同暴露时间的联合毒性作用

    • 图6是4组除草剂-杀虫剂混合物体系共20条射线在不同暴露时间下的绝对残差(dCA)值图。由图6可知，二元混合物体系OXA-CYA、OXA-DIQ和DIP-CYA的dCA值整体大于0，即表现为拮抗作用。其中OXA-CYA体系的R1到R3射线前24 h的dCA值是趋近0的，48—72 h的dCA峰值均没有到达20%，而R4、R5两条射线前24 h的dCA值则明显大于0，48—72 h的dCA值均突破20%分别达到23.26%和23.60%，各条射线96 h的dCA峰值则都在25%左右。这说明，OXA-CYA体系的拮抗作用强度是随着暴露时间和CYA所占浓度比的增加而增大的，即验证了CA模型中得到的结论：该体系具有典型的时间依赖和浓度比依赖毒性关系。

      根据图6可以明显看出，二元混合物体系OXA-DIQ和DIP-CYA的10条射线在前24 h的dCA值均在0附近，且随着暴露时间的增加，在48—96 h的dCA值逐渐增大，对比同一射线中各条曲线的峰值大小，我们也不难得出与CA模型相似的结论。只有DIP-DIQ体系下的5条射线dCA值整体小于0，但所有曲线的dCA峰值均没有超过-15%，表现为较弱的协同作用。

      • 2.4.   拓展等效线图法评价农药二元混合物的联合毒性作用

    • 4种农药的4组二元混合物体系在5个不同效应浓度水平(EC30、EC40、EC50、EC60和EC70)下的拓展等效线图如图7所示。

      从图7中可以看出，OXA-CYA、OXA-DIQ、DIP-CYA这3组二元混合物体系在不同射线和不同效应浓度水平下的拟合等效线均落在上方拮抗区域，只有DIP-DIQ体系整体表现为较弱的协同作用。

      在拓展等效线图中，可以直观对比同一混合物体系的5条射线在不同效应水平下所表现出的联合毒性关系。OXA-CYA体系中R5和R4射线的拮抗作用较其它3条射线更为明显，而在DIP-CYA体系中R3射线表现出最强的拮抗作用，这反映了两组体系中组分间的联合毒性随组分浓度比变化规律的差异。在DIP-DIQ体系中可以看出R3射线在5个效应水平下的协同作用均最弱。通过对比拟合等效线对预测线的偏离程度，我们可以发现效应水平越高各条射线的联合毒性差别越明显。通过拓展等效线图法分析评估4组混合物体系得到的结果与上文中通过CA模型和dCA模型得到的结论相似。

      将CA模型、dCA模型和拓展等效线图法的评估结果比较，可看出CA模型可以比较直观地描述各种类型混合物在整个浓度-效应曲线上的联合毒性作用动态变化规律，但同一混合物不同射线和不同暴露时间下的实验观测点、拟合线、CA预测线等需逐一画出，工作量大且不利于横向观察和对比。拓展等效线图法可以在从低到高多个效应水平下评估混合物的联合毒性关系，且可以将同一体系下的5条射线进行对比，使各体系组分间浓度比依赖关系表达的比较清晰直观，但只能用于两元混合物毒性的相互作用评估，且和CA模型一样不能给予相互作用强度赋值，如果加上置信区间的话，线条较多，也不利于观察。相比较CA模型和拓展等效线图法，dCA模型可以在整个浓度-效应曲线上定量的描述联合毒性作用的强度，但依赖CA预测结果，如果与CA模型相结合，可以定性定量评估各种混合物在整个浓度-效应曲线上相互作用的动态变化规律。综上所述，CA模型、dCA模型和拓展等效线图法在化学混合污染物的联合毒性评估方面具有各自的优缺点，但评估结果基本一致，可以根据实际情况选用一种或两种结合进行评估。

    3.   结论(Conclusion)

    • （1）Weibull函数对于4种农药在暴露时间72、96 h下的浓度-效应曲数据拟合结果都较好。4种农药的毒性由大到小依次为CYA>DIQ>OXA>DIP，且两种除草剂在48—96 h的EC50值均比两种杀虫剂的EC50值高出1—2个数量级。

      （2）除草剂与杀虫剂二元混合物OXA-CYA、OXA-DIQ、DIP-CYA的毒性作用整体上呈现由加和作用向拮抗作用转变，DIP-DIQ则呈现由加和作用向较弱的协同作用转变。OXA-CYA体系中CYA的浓度比主导了拮抗作用的强弱，且各混合物体系的毒性作用都具有时间依赖性和浓度比依赖性。

      （3）dCA模型和拓展等效线图法对4组混合物体系的评估结果与CA预测模型相似，但CA模型可以直观地描述所有混合物毒性作用的动态变化规律，dCA模型可以定量描述混合物毒性相互作用强度，拓展等效线图可以更加直观的描述两元混合物各组分间相互作用的浓度比依赖关系。

    参考文献 (30)

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