99.0%的CdCl₂（天津科密欧化学试剂有限公司），75%氯吡嘧磺隆水分散粒剂(江苏省农用激素工程技术研究中心)，斑马鱼(AB品系），体长均在3.0 cm±0.5 cm，斑马鱼在25 ℃±2 ℃下驯化。

752紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒、MDA含量测定试剂盒、CarE酶活性检测试剂盒：索莱宝生化试剂盒事业部。气相色谱-质谱联用：赛默飞世尔Trace1310串联TSQ8000；BSTFA∶TMCS=99∶1，美国Supelco。

准确称取氯吡嘧磺隆和镉（精确至0.0001g），分别配置两种物质的系列浓度标准溶液。参照《化学农药环境安全性评估测试指南-第12部分：鱼类急性毒性测试》（GB/T 31270.12-2014）^[3]进行预试验，控制溶液浓度使斑马鱼的死亡率在15%至85%区间。

将氯吡嘧磺隆和镉配制成混合污染物，采用两因素三水平正交组合设计，结合单因子试验测定结果设置不同的浓度，并观察染毒96 h斑马鱼的死亡率。依据96 h斑马鱼死亡率，评价两种物质的联合效应。

取96 h存活的斑马鱼，每个重复15条，每个处理3次重复。在冰浴状态下将肝脏混匀后称取0.1g的样品，并用0.8 %氯化钠水溶液溶液研磨提取。将提取液在4℃，10000 r·min⁻¹离心15 min，收集上清液用于检测CAT ，MDA和CarE，检测方法依据索莱宝试剂盒方法进行。

称取肝脏组织30 mg，加入液氮研磨粉碎，放入离心管，加0.5 mL甲醇∶水（1∶1, V∶V） 溶液，超声提取30 min。转速1000 r·min⁻¹，4 ℃离心15 min，取100 μL上清液放入2 mL进样小瓶中，氮气吹干。加入50 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液（20 g·L⁻¹， 含内标二十四烷 0. 1 g·L⁻¹），37℃反应90 min，再加入50 μL BSTFA+ 1% TMCS，37℃反应30 min。冷却后，进行GC-MS分析。

色谱：赛默飞TR-5MS毛细管柱（0.32 mm×30 m，0.25 μm）；进样口温度280℃；载气（He）流速1.0 mL·min⁻¹，不分流。升温程序：初始温度50℃，保持1min；以10℃·min⁻¹升至100℃，保持1min；再以10℃·min⁻¹升至320℃，保持1 min。溶剂延迟时间为5 min，进样量1 μL。

质谱：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度200 ℃；质量扫描范围m/z 50—650。

采用 DPS、SPSS 和Origin软件统计试验结果，并分析氯吡嘧磺隆和镉对斑马鱼的急性毒性联合效应，建立回归模型。采用解卷积技术并结合GMD数据库，对代谢物进行定性和定量分析。

依据预实验结果，采用DPS软件的生物测定剂量效应法计算得出镉和氯吡嘧磺隆的LC₅₀分别为 7.01 mg·L⁻¹和14.17 mg·L⁻¹；LC₂₅分别为5.12 mg·L⁻¹和 12.03 mg·L⁻¹，毒性回归方程分别为：y=2.6877x+2.7264，R²=0.9813，y=2.2167x+2.4476，R²=0.9679。依据毒性试验结果计算得出氯吡嘧磺隆和镉对斑马鱼的半致死浓度（LC₅₀），选择LC₂₅作为变量中值0水平，步长为2 mg·L⁻¹，根据二因素三水平组合设计，设置变量水平为-1、0、1得出9个处理组浓度（表1）。利用origin进行非线性曲面拟合，建立数学回归模型。得到回归方程模型，两因素对斑马鱼致死率、CAT、MDA和CarE影响的相互关系式见表2。

统计模型的形式为y=ax₁+bx₂+cx₁²+dx₂²+ex₁x₂，a，b，c，d和e 为拟合常数，P值均为0.000。从方程可以看出，双因素模型能较好的拟合镉和氯吡嘧磺隆对斑马鱼的急性毒性。模型中的各因素经过无量纲线性变换，因此可根据各系数的绝对值大小判定氯吡嘧磺隆和镉对斑马鱼的毒性大小，模型中一次项和二次项的顺序均为X₁ > X_2，由此可得出镉对斑马鱼的毒性效应大于氯吡嘧磺隆，这与单一效应的结果一致。

采用SPSS分析两因素之间的交互作用，通过主体间效应的P值，可以得出两因素对死亡率、CAT、CarE存在交互作用（P<0.01），对MDA则不存在交互作用（P=0.381）。

通过酶活性试验可得出，当镉浓度为3.12 mg·L⁻¹，氯吡嘧磺隆浓度为14.03 mg·L⁻¹的混合处理组酶活性变化最为显著。通过GC-MS斑马鱼肝脏代谢物进行分析，共检测到代谢物53种，与对照组相比，显著上升的物质有4种，3种物质没有显著变化，下调的物质有46种。

从代谢途径来看，共检测到嘌呤类代谢通路中的7种物质，鸟苷、肌苷、腺苷含量均显著下降；鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤含量显著上升；腺嘌呤含量没有显著变化。检测到嘧啶代谢通路中的4种物质，尿苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶含量显著下降；胞嘧啶含量没有显著变化。检测到糖酵解和三羧酸循环途径中的代谢物有10种，分别为蔗糖、葡萄糖、果糖、5-磷酸木酮糖、麦芽糖、丙酮酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸，与对照组相比，除富马酸没有显著变化，麦芽糖显著上升外，其余均显著下降。共检测到17种氨基酸，分别为缬氨酸、肌氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、5-羟基色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、酪氨酸。除缬氨酸、肌氨酸、亮氨酸、脯氨酸含量显著上升外；其余氨基酸含量均显著下降。检测到磷脂和鞘磷脂代谢通路中的5种物质，分别为磷酸、乙醇胺、磷酸乙醇胺、肌醇、胆固醇，所有物质含量均显著下降。检测出与维生素代谢相关的物质2种，分别为烟酸和α生育酚，两种物质均显著下降。检测到经丙酮酸代谢形成的癸酸、谷氨酸代谢形成的γ-氨基丁酸和牛磺酸的含量均显著下降。此外，还有十六烷酸、十八酸、组胺、腐胺、肌酸酐等物质的含量也显著下降。

本研究发现两种污染物复合处理造成斑马鱼肝脏中鸟苷、肌苷、腺苷、尿苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶含量显著下降，而鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤含量显著上升，表明两种物质引起斑马鱼氧化应激反应。农药和重金属胁迫时，会导致生物体内活性氧的产生，生物体产生氧化应激反应，进而引起细胞紊乱导致不同生物分子的变化，包括 DNA^[4]。核碱基损伤是DNA氧化损伤、修复和一般细胞氧化应激的标志物^[5], 其中对氧化应激反应最为敏感的碱基是鸟嘌呤。特别是出现在转录结合位点的鸟嘌呤和胞嘧啶含量丰富的序列更容易受到损伤。鸟嘌呤含量显著上升，可有效的刺激斑马鱼免疫反应，对肝脏起保护作用。研究发现乙醛酸途径中的两种物质乙醇胺和磷酸乙醇胺含量均显著下降，乙醇胺是磷酸乙醇胺的前体物质，磷酸乙醇胺又是磷脂酰乙醇胺的前体物质，磷脂酰乙醇胺是膜脂质的主要成分之一。万钱芬^[6]研究发现，T-2毒素会导致大鼠脏器中乙醇胺含量降低，与T-2毒素影响细胞完整性进而影响功能有关。本研究结果表明，乙醇胺和磷酸乙醇胺含量的降低会抑制后续胆碱的代谢，进而使得丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸（三种氨基酸含量均显著下降）代谢，以及磷脂和鞘磷脂代谢（肌醇、磷酸、胆固醇含量均显著下降）异常。

本研究分析了镉和氯吡嘧磺隆复合污染的9个处理组斑马鱼致死率、肝脏CAT、MDA及CarE 的变化。采用origin进行非线性曲面拟合，建立数学回归模型，对回归模型进行失拟性 F 检验和回归方程显著性分析。结果显示，双因素模型能较好的拟合镉和氯吡嘧磺隆对斑马鱼的急性毒性。对两个因素进行交互作用分析，结果表明镉和氯吡嘧磺隆对斑马鱼致死率、CAT和CarE存在交互作用（P<0.01），对MDA没有交互作用（P=0.381）。且两种物质共存时，镉的毒性效应最大。根据各指标检测结果可得，水中镉浓度3.12 mg·L⁻¹，氯吡嘧磺隆14.03 mg·L⁻¹时，两种物质的互作效应最大。该剂量复合处理引起斑马鱼核苷酸、乙醛酸、磷脂、氨基酸等代谢异常，多种代谢物含量显著下降。