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美度铵（meldonium，mildronate），又称米屈阱，最初作为一种生长促进剂用于动物养殖，此外，作为左旋肉碱抑制剂，在欧洲作为临床药物治疗糖尿病、神经退行性疾病和支气管肺疾病。就运动表现而言，对运动员运动能力、耐力以及运动后恢复均有促进作用。因此，2016年，世界反兴奋剂中心(WADA)将美度铵列入《禁用清单》S4. 激素及代谢调节剂。为了避免食品来源的兴奋剂污染，国家体育总局也于2021年发布《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》，要求大型赛事举办方对肉食品中食源性兴奋剂进行检测，其中美度铵的参考检出限 20 μg·kg−1。
美度铵的检测方法包括液相色谱-蒸发光散射检测法(LC-ELSD)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、超临界色谱-串联质谱法(SFC-MS/MS)、液相色谱-高分辨质谱法(LC-HRMS)等[1-5]。LC-ELSD检测法分析时间长，且易受基质干扰，满足不了痕量分析的需要；SFC-MS/MS分析速度快，但正相色谱柱易受样品中水的影响，不适合长期、大批量样品的分析；LC-MS/MS用于美度铵的分析，灵敏度高，抗干扰能力强，是适合大批量样品、稳定分析的最佳技术之一。美度铵极性强，前处理一般采用液液萃取的方式，目前报道的基质主要是尿液、血浆、干血斑等基质，而动物源性食品中美度铵的前处理研究尚未见报道。对于动物组织样品，基质更为复杂，需要更为有效的前处理方式，因此，亟需建立动物源性食品中美度铵的残留检测方法，以实现更加可靠有效的食源性兴奋剂污染控制。
本文利用碳酸氢铵缓冲溶液提取，HLB固相萃取净化，亲水作用色谱-串联质谱定性定量测定，建立了猪肉、虾中美度铵残留的检测方法，对提取效率、基质效应等进行了研究，并进行了详细的方法学考察。该方法快速、准确、灵敏度高，供相关行业参考。
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仪器 亲水作用色谱与三重四极杆质谱仪联用系统LCMS-8045，SHIMSEN Styra HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL），固相萃取仪，离心机，涡旋混匀器。
试剂 碳酸氢铵（国药），乙酸铵（Sigma），乙腈（Honeywell），正己烷（Merck），美度铵 (二水合物) ,≥98%（阿拉丁）.
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色谱条件 色谱柱：Shim-pack Velox HILIC（50 mm ×2.1 mm I.D., 2.7 μm），流动相：A为10 mmol·L−1乙酸铵水溶液， B为A:乙腈=95:5（V/V）；流速0.3 mL·min−1，梯度洗脱，0—6 min，80%—72%B，6.5—7.5 min，50%B，8—11 min，80%B；柱温35℃，进样体积：1 μL；
质谱条件：离子化模式：ESI, 正离子模式；离子喷雾电压：+4.5 kV；雾化气流速：氮气 3.0 L·min−1；加热气流速：氮气 10 L·min−1；干燥气流速：氮气10 L·min−1；DL温度：250°C；加热模块温度：400°C；离子源温度：300°C；扫描模式：多反应监测(MRM)；驻留时间：150 ms；延迟时间：3 ms；美度铵离子对：147.2>58.25, 碰撞能−27 eV；147.2>59.25,碰撞能−19 eV；147.2>42.10,碰撞能−55 eV；其中147.2>58.25离子对为定量离子对，其余为定性离子对。
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猪肉剔除油脂、虾去壳，均质，准确称取样品1.0 g，置于50 mL离心管中，准确加入50 mmol·L−1碳酸氢铵水：乙腈（3:7）缓冲液10.0 mL，涡旋30 s，超声提取5 min，17500 r·min−1均质30 s，加入10 mL正己烷，轻轻混匀， 4000 r·min−1转速离心10 min，弃去正己烷层，吸取2 mL清液过HLB固相萃取柱，收集上样液，过0.22 μm尼龙滤膜，上机。
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基质标准系列工作液的配制：以不含美度铵的样品为空白样品，按照前处理制备空白基质，以空白基质为溶剂，加入适量标准工作溶液，配制成浓度为0.5、1、2、5、20、100 ng·mL−1的基质匹配标准工作曲线，待上机分析。
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以保留时间、定性定量离子比例定性，基质标准工作曲线法定量。
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美度铵是β-氨基酸衍生物，属于两性化合物，在正离子模式下易形成[M+H]+，一级扫描得到前体离子为m/z 147.1。对前体离子进行二级扫描，碰撞能为−20eV时，容易形成大碎片m/z 59.1，继续增大碰撞能至−55eV，形成更小的碎片m/z 58.1、m/z 42.1. 利用仪器的自动优化功能，对碰撞能进行优化，最佳MRM参数参见1.2实验条件。
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美度铵极性很强，lgP为-1.4，因此在反相C8、C18色谱柱上无保留。从结构上看，采用烷基磺酸根离子对试剂，可实现反相模式保留，但离子对试剂的引入，会给质谱分析带来离子对残留、竞争离子化等新的挑战。而采用亲水作用色谱(HILIC)模式进行分析，可实现质谱兼容的高灵敏度分析。本文对比了Silica、Diol、Amide等几种常见的HILIC固定性的保留分离能力。Shim-pack Velox HILIC（50 mm × 2.1 mm I.D., 2.7 μm）、PC HILIC（150 mm × 2.0 mm I.D., 3 μm）、Shim-pack Diol HILIC（50 mm × 2.1 mm I.D., 2.7 μm）、Inersil HILIC（150 mm × 2.1 mm I.D., 3 μm）、Inersil Amide（100 mm × 2.1 mm I.D., 5 μm）、Glycan BEH Amide（150 mm × 2.1 mm I.D., 1.7 μm），Diol对于美度铵的保留较弱，难以分离基质中的干扰峰；两款Amide色谱柱对美度铵保留较好，可以分离猪肉基质中的干扰峰，但是虾基质中干扰峰更多，即使是填料颗粒更小、柱效更高的Glycan BEH Amide也无法实现分离；Silica固定相的色谱柱对美度铵干扰峰的保留分离效果更好，Shim-pack Velox HILIC、PC HILIC两款色谱柱对于猪肉、虾基质干扰均能实现较好分离，此外，Shim-pack Velox HILIC采用的是实心球颗粒的高纯硅胶，柱效高，平衡快，更适合质谱匹配的快速分析，本文最终选择Shim-pack Velox HILIC色谱柱（图1）。
流动相添加剂对色谱峰形，分离度有一定的影响，对比了10 mmol·L−1乙酸铵水、0.1%甲酸水、0.1%甲酸+10 mmol·L−1乙酸铵水的3种添加剂体系，添加甲酸导致色谱峰分叉，且美度铵与基质干扰峰之间的分离度下降，同时加甲酸对于质谱响应没有明显促进作用，因此，最终选择10 mmol·L−1乙酸铵作为流动相添加剂。
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美度铵分子量小，极性强，水溶性好，优先考虑使用含水比例高的提取试剂进行萃取，此外，肉类中蛋白质脂肪含量丰富，特别是水溶性氨基酸对分离测定干扰较大，需要一定的净化处理。本文对比了水/乙腈（1:9,V/V）、水/乙腈（1:9, V/V，含1%甲酸）、0.1 mol·L−1磷酸缓冲液/乙腈（1:9,V/V）、0.1 mol·L−1 EDTA-Mcllavine水溶液（pH=4.0、7.0、10.0）、50 mmol·L−1碳酸氢铵/乙腈（3:7,V/V）提取效率。20 ng·g−1单点基质标计算提取效率，水/乙腈（1:9,V/V）提取效率54%，其他提取试剂均可以80%—105%的提取率。水/乙腈（1:9,V/V，含1%甲酸）的提取效率90%，但是样品溶液pH较低，导致色谱分离度下降；0.1 mol·L−1磷酸缓冲液/乙腈（1:9,V/V）、0.1 mol·L−1 EDTA-Mcllavine水溶液在pH=4.0、7.0、10.0均可以实现90%以上的提取效率，但含磷酸盐的缓冲液容易在质谱离子源处形成结晶堵塞喷针，需要在净化过程中去除；50 mmol·L−1碳酸氢铵/乙腈（3:7,V/V）提取剂，乙腈沉淀蛋白的，同时缓冲盐溶液可以让肉分散，让肉中的药物充分分散释放，实现了101%的提取效率，此外，提取剂中水相比例不高于50%可以避免溶剂效应，有利于HILIC模式分析。
根据提取的试剂不同，采用两种固相萃取净化方式：一种是0.1 mol·L−1 EDTA-Mcllavine提取，净化时使用styra MCX、SCX、WCX固相萃取柱；第二种是50 mmol·L−1碳酸氢铵/乙腈（3:7,V/V）提取，styra HLB固相萃取柱净化。仅pH=4.0的0.1 mol·L−1 EDTA-Mcllavine提取后，在SCX有一定的保留，当上样体积增大时，美度铵被上样溶剂洗脱。50 mmol ·L−1碳酸氢铵/乙腈（3:7,V/V）提取后，经HLB净化，杂质保留在SPE柱上，美度铵完全洗脱，直接收集上样液，上机测试，回收率可达95%。HLB净化，可以实现对样品中弱极性至非极性组分净化。因此最终选择了挥发性的碳酸氢铵缓冲溶液作为提取剂，HLB净化的前处理方式。
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基质中共流出组分影响离子化效率，对目标物测定产生一定影响，称为基质效应。基质效应（ME）=样品提取后添加/纯的标准溶液，当ME＞1时，表现为基质增强效应；当ME＜1时，表现为基质抑制效应；当ME介于0.8—1.2之间时，通常认为不存在明显的基质增强或基质抑制效应，超出此范围表明存在较强基质效应，须进行基质效应补偿[6]。
采用基质匹配标准溶液的标准曲线斜率与溶剂标准溶液的标准曲线斜率的比值进行评价。配制系列浓度的溶剂标准曲线和基质标准曲线，溶液标准曲线、猪肉基质曲线、虾基质曲线结果显示，猪肉基质效应在59%，虾基质效应在27%，均存在明显的基质抑制效应。为了平衡基质效应对定量准确性的影响，本文采用基质匹配外标曲线法定量。
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按照1.4节配制基质匹配系列标准溶液，上机分析得出美度铵在猪肉、虾基质中线性范围和线性关系。结果表明，美度铵在5—1000 μg·kg−1范围内，线性良好，r2>0.995，权重1/C2。以空白样品加标测定信噪比，重复测定3次，以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限，检美度铵在猪肉、虾基质的检出限分别为0.2、0.3 μg·kg−1，美度铵的定量限在0.7、1.0 μg·kg−1。检出限满足《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》的要求。美度铵基质标准曲线、检出限和定量限见表1。
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选择空白猪肉、虾，进行5、10、50 μg·kg−1浓度的加标回收试验，每个加标浓度6个平行，按照前述前处理方式处理，上机测定，以基质外标曲线法定量，计算回收率。由表2可见，美度铵加标回收率81.8%—109.5%之间，RSD<15%。
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市场上购买了4份猪肉、3份虾样品进行了测定，结果显示，7份样品均未检出美度铵。
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本文建立了亲水作用色谱-三重四极杆质谱（HILIC-MS/MS）分析肉中美度铵残留量的检测方法。该方法采用HILIC模式分离，有效解决了质谱通道干扰，避免假阳性的发生，采用基质匹配标准曲线法定量，平衡了基质效应对定量准确度的影响，美度铵在猪肉、虾基质中5—1000 μg·kg−1的范围内线性良好，判定系数r2>0.995；采用碳酸氢铵缓冲溶液提取，Styra HLB固相萃取净化方式，5、10、50 μg·kg−1加标回收率81.8%—109.5%之间，RSD<15%，回收率良好。
亲水作用色谱-三重四极杆质谱法分析肉中代谢调节剂美度铵残留
Analysis of metabolic regulator Meldonium residues in meat by hydrophilic interaction chromatography-triple quadrupole mass spectrometry
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摘要: 本文采用亲水作用(HILIC)色谱-串联质谱，建立了肉类中代谢调节剂美度铵残留量的测定方法。肉类样品经碳酸氢铵-乙腈缓冲液提取，HLB固相萃取柱净化，经HILIC色谱分离，三重四极杆质谱多反应监测模式（MRM）测定，基质匹配外标曲线定量。结果显示，5—1000 μg·kg−1浓度范围内线性良好，判定系数r2均大于0.995，线性良好；猪肉、虾中美度铵的检出限分别为0.2、0.3 μg·kg−1，定量限分别为0.7、1.0 μg·kg−1，空白样品中加标5、10、50 μg·kg−1，加标回收率81.8%—109.5%之间。该方法简便，灵敏度高，准确度好。
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关键词:
- 三重四极杆液质联用法 /
- 美度铵 /
- 肉类 /
- 代谢调节剂 /
- 兴奋剂
Abstract: A method for determination of the residue of metabolizing regulator meldonium in meat was established by hydrophilic interaction (HILIC) chromatography tandem mass spectrometry. Meat samples were extracted by ammonium bicarbonate and acetonitrile buffer, purified by HLB solid phase extraction column, separated by HILIC chromatography, determined by triple quadrupole mass spectrometry multi reaction monitoring mode (MRM), and quantified by matrix matching external standard curve. The results show that the linearity is good in the concentration range of 5—1000 μg·kg−1, and the determination coefficient r2 is greater than 0.995; The limits of detection of mildonium in pork and shrimp were 0.2 μg·kg−1 and 0.3 μg·kg−1 respectively, and the limits of quantitative were 0.7 μg·kg−1 and 1.0 μg·kg−1 respectively; Blank meat and shrimp spiked 5, 10 and 50 μg·kg−1 concentration of meldonium, the recovery rate is between 81.8% and 109.5%. The method is simple, sensitive and accurate. -
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图 1 猪肉、虾基质中美度铵的MRM色谱图(Velox HILIC色谱柱)
Figure 1. MRM chromatogram of meldonium in pork and shrimp matrix(Velox HILIC Column)
表 1 美度铵基质标准曲线的线性关系、检出限
Table 1. Calibration and detection limits of meldonium in pork and shrimp matrix
化合物 基质 线性方程 判定系数r2 检出限/（μg·kg-1） 定量限/（μg·kg-1） 美度铵 猪肉 Y =136318.3X +8170.1 0.9988 0.2 0.7 虾 Y =34568.9X +9147.8 0.9955 0.3 1.0 
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表 2 美度铵在猪肉、虾基质加标回收率
Table 2. Recovery and precision of meldonium in pork and shrimp
基质 浓度/(μg·kg−1) 回收率/% RSD/% 猪肉 5 81.8 6 10 88.6 5 50 100.6 3 虾 5 88.9 15 10 90.9 15 50 109.5 12
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