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佛手为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle的干燥果实，主要含有黄酮类、香豆素类、挥发油类和柠檬苦素类化学成分[1-3]。电雾式检测器（CAD）是近年来发展起来的一种新型通用检测器，其响应值依赖于分析物的初始质量浓度而与分析物的化学性质无关，尤其适用于皂苷类、糖类化合物等无紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析与检测[4-5]。本研究拟建立HPLC-DAD-CAD法同时测定川佛手中黄酮类、香豆素类和柠檬苦素类化合物含量的方法，可为川佛手药材的质量控制方法的研究提供进一步的参考。
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Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪、DAD-3000RS检测器和Corona Veo电雾式检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；BS124S 万分之一分析天平和BT25S 十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
对照品香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素和柠檬苦素（四川恒诚致远生物科技公司，批号分别为2201009801、2201186901、1211325801、1211010301），诺米林（四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkq21051013），纯度均≥98%。甲醇（分析纯，成都市科隆化学品公司），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），乙腈（色谱级，美国Fisher公司），甲酸（色谱级，成都市科隆化学品公司），二甲基亚砜（分析纯，成都市科隆化学品公司），怡宝纯净水。
川佛手药材共8批，分别采集于四川省眉山市仁寿县(3批)、四川省雅安市石棉县(4批)及四川省内江市威远县（1批），经成都中医药大学龙飞副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle的干燥果实。
对照品溶液的制备 分别精密称取香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林对照品适量，其中香叶木苷加二甲基亚砜溶解，其余对照品加甲醇溶解，分别定容至10 mL，摇匀，即得浓度分别为533、512、515、411、638 μg·mL−1的对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量制得不同浓度的混合对照品溶液。香叶木苷浓度分别为53.30、26.65、21.32、13.33、10.66 μg·mL−1，橙皮苷浓度分别为51.20、25.60、20.48、12.80、10.24 μg·mL−1，5,7-二甲氧基香豆素浓度分别为51.50、25.75、20.60、12.88、10.30 μg·mL−1，柠檬苦素浓度分别为41.10、20.55、16.44、10.28、8.22 μg·mL−1，诺米林浓度分别为63.80、31.90、25.52、15.95、12.76 μg·mL−1。
供试品溶液的制备 精密称取川佛手粉末（过2号筛）约1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定重量，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
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色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈为流动相A，0.1%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0—8 min，20%A；8—10 min，20%→30%A；10—15 min，30%A；15—17 min，30%→53%A，17—25 min，53%A）；流速：1 mL·min−1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：254 nm；CAD检测器雾化温度35 ℃，采集频率10 Hz，过滤常数5.0 s。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测，混合对照品和供试品溶液的色谱图见图1。
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分别精密吸取上述混合对照品溶液各10 μL按上述色谱条件进样测定，以进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表1，r均大于0.999，呈良好线性关系。
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同一混合对照品溶液，连续测定6次，测得香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林的RSD值分别为0.51%、0.48%、0.29%、0.98%、1.61%，表明仪器精密度良好。
精密称取川佛手粉末，制备供试品溶液，分别于0、1、2、8、10、12 h进行测定，记录峰面积并计算RSD值。结果香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD值分别为1.90%、2.05%、1.65%、2.20%、0.82%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
精密称取取样品粉末1.0 g，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，测得香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林的平均含量分别为0.8242、1.2044、0.9526、0.2358、1.1366 mg·g−1，RSD值分别为1.62%、2.63%、0.98%、2.58%、1.81%，表明方法重复性良好。
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精密称取川佛手样品粉末0.5 g，平行6份，分别加入5种成分对照品适量，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林的平均回收率分别为105.04%、107.19%、98.39%、105.01%、94.33%，RSD值分别为1.96%、1.67%、2.72%、2.39%、0.45%。
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分别精密称取8批川佛手药材的粉末，制备供试品溶液，进行测定，记录峰面积，采用外标法计算香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林的含量。结果显示，8批川佛手中橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林百分含量的范围分别为0.026%—0.168%、0.036%—0.081%、0.064%—0.256%、0.016%—0.084%、0.068%—0.116%，除一批样品外，实验所测样品橙皮苷含量均合格，5个成分总含量为0.31%—0.65%。
香叶木苷、橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素等3个成分在紫外检测器下吸收较强，254 nm波长下色谱图基线平稳，与CAD检测器相比响应更好，灵敏度更高；柠檬苦素和诺米林在254 nm波长下吸光度较弱，在210 nm波长下吸光度强，但色谱图基线漂移较大，而在CAD检测器下信号较强，灵敏度远大于DAD检测器，故本实验采用DAD检测器在254 nm波长处对香叶木苷、橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素进行检测，采用CAD检测器对柠檬苦素和诺米林进行检测。各成分在不同检测条件下定量限（按S/N=10计算）如表2所示。
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本实验采用HPLC-DAD-CAD技术建立同时测定川佛手中香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林5种成分含量的方法，操作简单、快速准确、重复性好，为多指标控制川佛手药材质量奠定了实验基础。
HPLC-DAD-CAD法同时测定川佛手中5个成分的含量
Simultaneous determiation of five constituents in citri sarcodactylis fructus by HPLC-DAD-CAD
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摘要: 建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-电雾式检测器（HPLC-DAD-CAD）法同时测定川佛手中香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林等5个成分含量的方法。研究结果表明，川佛手中香叶木苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林分别在106.6—533 ng（r=0.9998）、102.4—512 ng（r=0.9999）、103.0—515 ng（r=0.9999）、82.2—411 ng（r=0.9996）、127.6—638 ng（r=0.9994）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为105.04%、107.19%、98.39%、105.01%、94.33%，RSD值分别为1.96%、1.67%、2.72%、2.39%、0.45%。8批样品中橙皮苷、香叶木苷、5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素和诺米林的百分含量分别为0.026%—0.168%、0.036%—0.081%、0.064%—0.256%、0.016%—0.084%、0.068%—0.116%。建立的HPLC-DAD-CAD测定5个成分含量的方法稳定可靠，重复性好，可为川佛手的质量控制方法研究提供参考。
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关键词:
- 佛手 /
- 高效液相色谱-二极管阵列检测器-电雾式检测器 /
- 香叶木苷 /
- 橙皮苷 /
- 5,7-二甲氧基香豆素 /
- 柠檬苦素 /
- 诺米林
Abstract: To establish a method for the simultaneous determination of diosmin, hesperidin, 5,7-dimethoxycoumarin, limonin and nomilin in Citri Sarcodactylis Fructus by high performance liquid chromatography coupled with diode array and charged aerosol detector (HPLC-DAD-CAD). Results: The concentrations of diosmin, hesperidin, 5,7-dimethoxycoumarin, limonin and normilin were 106.6—533 ng (r=0.9998), 102.4—512 ng (r=0.9999), 103.0—515 ng (r=0.9999) and 82.2—411 ng (r=0.9996), 127.6—638 ng (r=0.9994), respectively The average recoveries were 105.04%, 107.19%, 98.39%, 105.01% and 94.33%, respectively. The average recoveries were 105.04%, 107.19%, 98.39%, 105.01% and 94.33%, respectively. RSD values were 1.96%, 1.67%, 2.72%, 2.39% and 0.45%, respectively. The contents of hesperidin, diosmin, 5,7-dimethoxycoumarin, limonin and nomilin in 8 batches of samples were 0.026%—0.168%、0.036%—0.081%、0.064%—0.256%、0.016%—0.084% and 0.068%—0.116%, respectively. Conclusion: The established HPLC-DAD-CAD method is stable, reliable and reproducible, which can provide a reference for the study of quality control methods of Citri Sarcodactylis Fructus.-
Key words:
- citri sarcodactylis fructus /
- HPLC-DAD-CAD /
- diosmin /
- hesperidin /
- 5,7-dimethoxycoumarin /
- limonin /
- nomilin
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图 1 混合对照品和供试品溶液HPLC图
Figure 1. HPLC diagram of mixed reference substance and test substance solution
表 1 川佛手中5个成分的线性关系
Table 1. Linear relationship of the five components in Citri Sarcodactylis Fructus
成分 回归方程 r 线性范围/ng 香叶木苷 Y= 26.892X + 0.0712 0.9998 106.6—533 橙皮苷 Y= 4.3514X + 0.0081 0.9999 102.4—512 5,7-二甲氧基香豆素 Y= 29.943X+ 0.1032 0.9999 103.0—515 柠檬苦素 Y= 3.7400X + 0.1339 0.9996 82.2—411 诺米林 Y = 3.6195X+ 0.1970 0.9994 127.6—638 
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表 2 定量限测定结果
Table 2. Limits of quantitation results
定量限/ng 香叶木苷 橙皮苷 5,7-二甲氧基香豆素 柠檬苦素 诺米林 DAD检测器 26.65（254 nm） 102.4（254 nm） 1.03（254 nm） 978.6（210 nm） 671.6（210 nm） CAD检测器 339.5 1506 572.2 82.2 63.8
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[1] 胡瀚文, 赵永艳, 杨天龙, 等. 基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS的川佛手化学成分分析 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2020, 26(7): 148-155. [2] 崔广林, 李隆云, 谭均, 等. 不同产地川佛手中8种化学成分的分析与评价 [J]. 天然产物研究与开发, 2019, 31(2): 250-260,324. [3] 区耿华, 让一峰, 黄卓权, 等. 佛手提取物的化学成分和生物活性研究进展 [J]. 食品科技, 2021, 46(9): 169-174. [4] 斯乐婷, 倪鸿飞, 李倩, 等. HPLC-CAD法同时测定腰痹通胶囊中5种皂苷含量 [J]. 药学学报, 2020, 55(10): 2449-2453. [5] 袁明昊, 魏蔼玲, 刘红梅, 等. 电雾式检测器在中药分析中的应用 [J]. 中成药, 2021, 43(7): 1852-1857. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2021.07.031 -
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