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兴奋剂作为全球体育竞技中的违禁用药物,国际奥委会对兴奋剂一直保持着“零容忍”的态度。近年来,肉类食品饮食污染导致食源性兴奋剂事件层出不穷。据体育总局反兴奋剂中心《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》(体反兴奋字[2021]584号)明确规定β-受体激动剂、利尿剂和糖皮质激素等兴奋剂为禁用药物,食源性兴奋剂准确测定不仅为体育赛事食品安全保驾护航,同时也促进我国食品行业健康发展。
食源性兴奋剂检测手段主要有液质联用法[1-2]、高效液相色谱法[3]、气质联用法[4] 及UPLC-Q-TOF-MS法[5]等。在实验室检测过程中,往往用加标回收和基体标准品等质控手段进行质量控制[6]。但加标回收率并不能很好反映样品提取效率,现有基体标准品基质种类受限,价格高昂,很难满足实际工作中的检测需求,目前未见关于食源性兴奋剂残留质控品制备技术的研究报道。
本研究以火腿肠为代表性基质,开发了多种食源性兴奋剂质控样品的研制方法,采用单因素方差分析、t-检验等统计学方法对制备的兴奋剂质控品特性值进行均匀性及稳定性评价;对质控样品实验室内以及实验室间定值测定数据进行格拉布斯检验以及科克伦等精度检验,排除异常值,并对其进行不确定度评价。
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LCMS-8050-液相色谱质谱联用仪(日本SHIMADZU公司);AdVantageXL-70真空冷冻干燥机(美国SP SCICENTIFIC公司);Milli-Q 超纯水制备仪(美国Millipore公司);标准试验筛(40目);Sigma 3K-15型离心机(美国Sigma公司);N-EVAP112氮吹仪(美国organomation公司);Milli-Q纯化系统(美国Millipore公司);Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,1.7 µm,美国Waters公司);C18、中性氧化铝分散固相粉末(均购于上海安谱实验科技股份有限公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司)、甲醇(色谱纯,上海Anpel公司)、甲酸(色谱纯,美国Dikma公司)、乙酸、乙酸钠、氯化钠(分析纯,天津市永大化学试剂有限公司)。
喷布特罗(99.7%)、克伦特罗(99.6%)、托拉塞米(99.1%)以及可的松(98.5 %)标准物质均购自北京曼哈格生物科技有限公司;丙酸睾酮(99.9%)、睾酮(99.3%)、氯噻嗪(99.3%)以及甲基泼尼松龙(99.3%)标准物质均购自广州硕谱生物科技有限公司。
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本研究以火腿肠为基质,以8种兴奋剂为加标物质,制备不同浓度水平的食源性兴奋剂质控品。参考各药物限量及日常阳性样品检出浓度,确定喷布特罗浓度水平为6.5 μg·kg−1,克伦特罗浓度水平为3.5 μg·kg−1,睾酮浓度水平为15 μg·kg−1,丙酸睾酮浓度水平为15 μg·kg−1,甲基泼尼松龙浓度水平为7 μg·kg−1,可的松浓度水平为10 μg·kg−1,氯噻嗪浓度水平为15 μg·kg−1,托拉塞米浓度水平为20 μg·kg−1。制备过程如下所示:
(1)标准溶液配制
取8种兴奋剂药物各0.01 g(精确至10 mg),置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,配制成浓度为1 mg·mL−1的各化合物标准储备液,置于-18℃避光保存。移取各化合物储备液1 mL,用水溶解,分别配制成浓度为10 μg·mL−1标准中间溶液,于4℃保存。
(2)基质的筛选与制备
本研究以火腿肠(购自河北石家庄某超市)为基质。以张海超等[7]的检测方法对火腿肠样品中兴奋剂进行检测。结果均为未检出,作为制备质控品空白基质。将其倒入均质机中充分绞碎。加入一定体积的10 μg·mL−1标准工作液,以500 r·min−1,搅拌5 h。
(3)真空冷冻干燥
将混匀样品平铺于冷冻干燥盘,平铺厚度0.5 cm左右,-40℃下预冷冻30 min,打开真空泵,使干燥箱箱体压力至26.6 Pa,冷冻干燥24 h。冻干完成后的样品转移至粉碎机中,充分打碎混匀,过40目筛。将过筛后的样品按照检测方法进行均匀性检验,检验合格后按每袋5 g进行真空分装,若未混合均匀则需继续进行混合,直至样品均匀性符合要求。共制备252 袋质控样品。
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取冻干质控品1.25 g(精确至0.001 g),加入3.75 mL超纯水复溶,振荡涡旋,静置30 min,使其恢复至匀浆。加入0.2 mol·L−1乙酸钠(pH 5.2)溶液8 mL,再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液50 µL,涡旋混匀,于37°C下水浴16 h。样品酶解后冷却至室温,加入20 mL乙腈、5 g氯化钠,均质1 min,10000 r·min−1离心5 min。取10 mL乙腈层至另一离心管中,加入10 mL乙腈饱和正己烷,涡旋振荡1 min弃去正己烷层,再加入10 mL乙腈饱和正己烷重复操作1次。取上清液6 mL置于50 mg C18和300 mg中性氧化铝的另一离心管中,涡旋振荡2 min,10000 r·min−1高速5 min。准确移取5 mL上清液于10 mL离心管中,40℃氮吹至干,用1 mL甲醇-水(1∶1,V/V)溶液溶解残渣。经0.22 μm滤膜过滤,用液相色谱-串联质谱仪测定。冻干样品结果以复溶后质量进行计算,并保留三位有效数字。液相条件:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm,2.1 mm× 100 mm);流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0—1 min,5%B;8.00 min—9.00 min,90%B;9.00 min—9.50 min,90%B—95%B;9.50 min—11.00 min,95%B;11.00 min—11.01 min,95%B—5%B;11.01 min—13.00 min,5%B;柱温35℃,进样体积5 μL。质谱条件:电喷雾电离源;正离子扫描模式以及负离子扫描模式;多反应监测;离子源温度300℃;碰撞气:氩气;干燥气:氮气;雾化气流速3.0 L·min−1。质谱参数见表1所示。
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据《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对数据进行统计分析,依照给定显著水平(α = 0.05)计算相应检验统计量F值,若F值小于临界值Fα,表明样品间及样品内无显著性差异,样品是均匀的。
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据《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,考察质控样品在不同环境温度下对其稳定性的影响。采用独立样本t检验法,与初始测量数据进行比较分析,若在显著性水平α = 0.05,t值小于临界值tα,说明两组之间无显著差异,在对应条件下样品是稳定的。
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按《标准物质定值的通用原则及统计学原理》相关要求,将冻干质控品随机送往10家实验室,每家实验室平行测定4次,汇总各家实验室数据。对汇总数据采用SPSS 26.0统计软件进行正态性分析,采用格拉布斯法(Grubbs检验)分析10家实验室测定结果平均值中最大值与最小值是否为离群值,采用科克伦等精度检验法(Cochran)对实验室内变异进行考察,对最大标准差进行检验。经检验合格后,最终测定结果平均值作为该质控样品的参考值。
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经统计软件SPSS 26.0对各组数据进行方差齐性检验,数据均服从方差齐性检验要求(P>0.05);经单因素方差分析表明,测试组中组内自由度为10,组间自由度为9,质控样品中的喷布特罗(F = 1.253)、克伦特罗(F = 1.399)、丙酸睾酮(F = 1.590)、睾酮(F = 1.044)、可的松(F = 1.766)、甲基泼尼松龙(F = 2.543)、氯噻嗪(F = 2.140)、托拉塞米(F = 1.811)的均小于F临界值(F0.05(9,10)= 3.020)。添加的8种兴奋剂在火腿肠中混合均匀。
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按稳定性验证的相关要求,冻干质控品在常温(25℃)和高温(37℃)两个条件下存放15 d,每5天测量1次,均与初始测量值进行比较。对各组数据进行正态性检验,结果表明各组数据均服从正态分布(P>0.05);经过t检验统计分析,发现0—15 d,常温(25℃)保存环境中,8种兴奋剂的t值范围在0.09—2.03之间,均小于t临界值(2.07);高温(37℃)保存环境,8种兴奋剂的t值范围在0.29—11.06之间,第5天除甲基泼尼松龙(t = 1.11)、氯噻嗪(t = 1.51)、睾酮(t = 0.29)、丙酸睾酮(t = 0.92)之外,其余兴奋剂t值均大于t临界值(2.07),第10天8种兴奋剂的t值均大于t临界值(2.07)。结果显示,该兴奋剂质控样品在常温(25℃)条件存放15天,稳定性良好;而在高温(37℃)条件下存放15 d,随着时间推移,均出现不同程度降解。表明该质控样品在春秋冬季可采用常温运输,夏季高温环境下应采用低温运输。
将分装的质控品放置在低温(-20℃)条件下6个月,每2个月随机抽取6袋质控品平行测定2次,考察该质控品长期稳定性。所有兴奋剂药物的t值范围在0.182—2.005之间,均小于t临界值(2.07)。结果表明该质控样品在低温(−20℃)下,可保存6个月。
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选取10家实验室,按照相关检测方法检测质控品中目标物含量。汇总各实验室测量数据。经分析发现各组数据P值均在0.141—0.725之间(P > 0.05),数据服从正态分布。经格拉布斯检验,质控品中8种兴奋剂实验室数据值的G值在0.185—1.829之间,均< G0.05(2.290),各实验室数据均不存在异常值;经科克伦等精度检验,各组数据C值在0.150—0.302之间,均< C(0.05, 10, 4)(0.3733),表明各实验室数据精度良好,无随机误差过大的实验室。2.4兴奋剂质控品不确定度评定
据《测量不确定度评定与表示》对质控品不确定度进行评定。分析质控品从制备到定值过程中产生的不确定度;汇总对质控样品影响较大的不确定度来源以及置信水平P = 95%,包含因子k = 2的扩展不确定度UP。本质控样品不确定度来源有4个方面:均匀性(ubb)、长期(ults)和短期(usts)稳定性以及定值测定(uchar)。由于质控品是协同定值,短期稳定性存在实验室的测量数值中,故短期稳定性不确定度(usts)为0。不确定度分析结果见表2。
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据《测量不确定度评定与表示》,本质控品在置信区间P = 95%,k = 2条件下,定值表示结果:喷布特罗(5.69±0.412)μg·kg−1、克伦特罗(2.96±0.270)μg·kg−1、丙酸睾酮(12.7±1.642)μg·kg−1、睾酮(12.6±1.633)μg·kg−1、可的松(9.85±1.145)μg·kg−1、甲基泼尼松龙(5.92±0.534)μg·kg−1、氯噻嗪(13.2±1.721)μg·kg−1以及托拉塞米(17.5±2.341)μg·kg−1.
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将制备的兴奋剂质控品随机编号成考核盲样,采用农业部1025号公告-18-2008和农业部1031号公告-1-2008两个标准方法进行检测,用于实验室8名检测人员的喷布特罗、克伦特罗、丙酸睾酮、睾酮的操作水平考核。结果显示,8份考核盲样共32个检测项目回收率在70.8%—104.2%,回收率> 80% 有30个项目,正确率为93.7%。
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本研究建立的多种食源性兴奋剂质控品制备方法,以火腿肠为制备基质,添加喷布特罗、克伦特罗、丙酸睾酮等8种兴奋剂标准物质,采用冷冻干燥技术制得不同含量的兴奋剂冻干粉质控样品,并采用单因素方差分析、t-检验、Grubbs检验以及Cochran检验考察质控品特性值。该方法制备流程简单,具备一套系统化分析验证流程,并将统计学分析方法较好的运用于质控样品评价体系及性能验证。本方法研制的质控品中各药物具备良好的均匀性,在低温环境中可长期保存,并运用于实验室日常检测、实验室能力验证以及快速检测等领域。
肉制品中多种食源性兴奋剂质控样品的研制及评价-以火腿肠为例
Development and evaluation of quality control samples for multiple edible stimulants in meat products-Ham sausage as an example
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摘要: 本研究以火腿肠为基质,研制了肉制品中8种食源性兴奋剂质控样品的制备方法并对质控样品进行了分析评价。方法以β-受体激动剂、蛋白同化剂、糖皮质激素和利尿剂为目标物采用真空冷冻干燥,基质添加的方式制备质控样品,采用液相色谱-串联质谱法对质控样品中目标物进行测定。质控样品经F检验后具有良好的均匀性,经t检验后在常温(25℃)存放15d以及低温(−20℃)存放6个月具有良好的稳定性,并通过 10家实验室对质控样品进行联合定值,最终确定质控样品最终定值结果:喷布特罗为(5.69 ± 0.412)μg·kg−1、克伦特罗为(2.96 ± 0.270)μg·kg−1、丙酸睾酮为(12.7 ± 1.642)μg·kg−1、睾酮为(12.6 ± 1.633)μg·kg−1、可的松为(9.85 ± 1.145)μg·kg−1、甲基泼尼松龙为(5.92 ± 0.534)μg·kg−1、氯噻嗪为(13.2 ± 1.721)μg·kg−1、托拉塞米为(17.5 ± 2.341)μg·kg−1。Abstract: In this study, 8 kinds of food stimulant quality control samples in meat products were prepared using ham sausage as the matrix, and the quality control samples were analyzed and evaluated. The target substances of β-agonist, anabolic agent, glucocorticoid and diuretic were prepared by vacuum freeze-drying and matrix addition, and the target substances were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the mass control samples. The quality control samples had good homogeneity after F-test and good stability after t-test at room temperature (25℃) for 15 days and at low temperature (−20℃) for 6 months, and through the 10 laboratories on the quality control samples for joint determination, and finally determine the final quality control sample determination results: Penbutolol to (5.69±0.412) μg·kg−1, clenbuterol to (2.96±0.270) μg·kg−1, testosterone propionate to (12.7±1.642) μg·kg−1, testosterone to (12.6±1.633) μg·kg−1, cortisone to (9.85±1.145) μg·kg−1, methylprednisone to (5.92±0.534) μg·kg−1, chlorothiazide to (13.2±1.721) μg·kg−1, torsemide to (17.5±2.341) μg·kg−1. The preparation techniques of edible stimulant quality control samples of multiple species and levels in meat products established were rigorous and reliable, and can be used for quality control and blind sample assessment of edible stimulant residue analysis.
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Key words:
- edible stimulants /
- quality control samples /
- homogeneity /
- stability /
- quantification /
- meat products
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表 1 8种兴奋剂的质谱参数
Table 1. Mass spectrometry parameters of 8 stimulants
质谱参数 喷布特罗 克伦特罗 丙酸睾酮 睾酮 甲基泼尼松龙 可的松 氯噻嗪 托拉塞米 电离模式 + + + + + − − + 母离子(m/z) 292.2 277.1 345.3 289.2 375.2 405.1 293.9 349.1 子离子(m/z) 236.2*
201.2203.1*
132.197.1*
109.197.1*
109.1161.2*
253.3329.1*
359.1214.0*
179.0264.1*
290.0碰撞能/V −20.0
−21.0−18.0
−29.0−27.0
−28.0−25.0
−24.0−24.0
−21.016.0
9.029.0
44.0−16.0
−14.0“*”为定量离子. 表 2 质控品不确定度评定
Table 2. Evaluation of uncertainty of quality control samples
药物
Drugs不确定度来源Uncertainty sources 合成不确定度
Synthetic uncertainty扩展不确定度
Extended Uncertainty(P = 95%,k = 2)uchar ubb ults usts 喷布特罗 0.032 0.008 0.015 0.000 0.206 0.412 克伦特罗 0.042 0.008 0.016 0.000 0.135 0.270 丙酸睾酮 0.063 0.010 0.011 0.000 0.821 1.642 睾酮 0.059 0.018 0.020 0.000 0.816 1.633 可的松 0.056 0.012 0.010 0.000 0.573 1.145 甲基泼尼松龙 0.036 0.010 0.025 0.000 0.267 0.534 氯噻嗪 0.063 0.008 0.015 0.000 0.861 1.721 托拉塞米 0.059 0.022 0.023 0.000 1.170 2.341 -
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