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氟吡禾灵是应用广泛的苯氧羧酸类除草剂[1]，主要以氟吡禾灵酯（含氟吡甲禾灵、氟吡乙禾灵及共轭物）形式生产和使用. GB 2763-2021 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了氟吡甲禾灵、氟吡禾灵及其共轭物之和，以氟吡甲禾灵表示，氟吡甲禾灵的最大摄入量为0.0007 mg·kg−1 bw，并规定了氟吡甲禾灵在植物源性食品中的最大残留量为0.02—3 mg·kg−1. 禽蛋在居民的饮食中占有重要地位. 在禽类养殖中，氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物经过禽类饲料等途径进入到禽蛋中. 目前，氟吡禾灵残留检测的研究对象均是植物源性食品，在禽蛋中残留的检测研究未见报道. 因此，快速和准确测定禽蛋中氟吡禾灵残留量对保障人体健康有非常重要的意义.
检测氟吡禾灵残留量的方法有气相色谱法（GC）[2]、液相色谱法（LC）[3]、液质联用法（HPLC-MS/MS）[4]等. GC 法和LC法易受样品基质干扰，目标峰峰型较差，结果存在假阳性、回收率低等缺点. HPLC-MS/MS有较好的选择性和特异性，对样品溶液净化程度要求低，不易受基质干扰，灵敏度较高，是检测氟吡禾灵的最佳方法. 本研究通过加入同位素内标，优化禽蛋样品的水解条件，将氟吡禾灵酯及共轭物水解为氟吡禾灵后采用分散固相萃取（DSPE）进行前处理，建立测定禽蛋中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量的分散固相萃取-同位素内标-液相色谱串联三重四极杆质谱法，为监管部门监控禽蛋中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量提供快速的分析技术.
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三重四级杆液质联用仪：LCMS-8060，日本岛津公司；色谱柱：UPLC-UPLC HSS C18 （50 mm × 2.1 mm I.D., 1.8 μm），美国沃特世科技有限公司；冷冻离心机：5810R，德国艾本德股份公司；天平：MS204TS/02，瑞士梅特勒-托利多集团；氮吹仪：Turbovap LV，英国Biotage公司；涡旋振荡器：Multi Reax，德国heidolph集团.
氟吡甲禾灵标准溶液：浓度1000 mg·L−1，批号2252009，上海安谱璀世标准技术有限公司；氟吡禾灵标准溶液：浓度1000 mg·L−1，批号S100181，天津阿尔塔科技有限公司；D4-氟吡禾灵标准溶液：浓度1000 mg·L−1，批号S124077，天津阿尔塔科技有限公司.
乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）：40 µm，上海安谱实验科技股份有限公司；十八烷基硅烷（C18）：40-63 µm，上海安谱实验科技股份有限公司；石墨化碳黑（GCB）：100 μm，纳谱分析技术（苏州）有限公司；乙腈：色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司；氢氧化钠、无水硫酸镁和乙酸钠：分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司；
样品：禽蛋种类：鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋、鹌鹑蛋；采样量：2 kg；采样地点：重庆市两江新区人和农贸市场；样品个数：每种禽蛋均有2种（散装和盒装）包装形式，共10个样品.
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100 mg·L−1氟吡甲禾灵标准储备溶液1（氟吡禾灵标准储备溶液1）：移取氟吡甲禾灵标准溶液（氟吡禾灵标准溶液）1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，-18℃以下避光保存，备用；
1.0 mg·L−1 氟吡甲禾灵标准储备溶液2（氟吡禾灵标准储备溶液2）：移取0.10 mL氟吡甲禾灵标准储备溶液1（氟吡禾灵标准储备溶液1）于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，-18℃以下避光保存，备用；
5 mg·L−1 D4-氟吡禾灵储备溶液：准确移取0.5 mLD4-氟吡禾灵标准溶液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，-18℃以下避光保存，备用；
氟吡禾灵标准工作溶液：移取0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mL氟吡禾灵储备溶液2于10 mL容量瓶中，加入0.10 mL D4-氟吡禾灵储备溶液，乙腈定容，得到氟吡禾灵浓度为1、2、5、10、50、100、500 μg·L−1，内标浓度为50 μg·L−1的工作溶液.
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将购于农贸市场的禽蛋，去壳后充分混匀，于−18℃以下保存备用.
称取试样5.00 g于50 mL离心管中，加0.10 mLD4-氟吡禾灵储备溶液、10 mL乙腈、2 mL 氢氧化钠溶液（5 mol·L−1），迅速涡旋混匀1 min，于40℃水浴中超声20 min. 加2 mL硫酸溶液（2.5 mol·L−1）后涡旋混匀，加5 g无水硫酸镁、1.5 g 乙酸钠，涡旋1 min，6000 r·min−1冷冻离心5 min，取4 mL上清液于装有150 mgMgSO4、100 mgGCB和100 mgC18的离心管中，涡旋30 s，6000 r·min−1离心4 min，取1 mL上清液过0.22 µm滤膜，待测.
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流动相：A相- 0.1%甲酸水溶液，B相-乙腈；流速：0.2 mL·min−1；柱温：40℃；进样量：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱，信息见表1；离子源：ESI（+）；离子源接口电压：4 kV；雾化气：氮气 3.0 L·min−1；干燥气：氮气，10.0 L·min−1；加热气：空气，10.0 L·min−1；碰撞气：氩气；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；接口温度：300℃；扫描模式：MRM；MRM参数：见表2；扫描方式：正离子扫描（ESI+）.
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按下面公式（1）计算待测样品中氟吡禾灵的含量.
X为待测样品中氟吡禾灵的含量（mg·kg−1）；c1为待测溶液中氟吡禾灵的浓度（μg·L−1）；c0为空白溶液中氟吡禾灵的浓度（μg·L−1）；V为样液的定容体积（mL）； m为待测样称样量（g）；1000位单位换算系数.
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以鸡蛋为研究对象，在鸡蛋中添加0.1 mg·kg−1氟吡甲禾灵，作为研究试验前处理条件的阳性样品.
提取溶剂 在一样的前处理条件下，考察乙腈、乙醇和甲醇等3种溶剂（因禽蛋中含11%的脂肪，这3种溶剂除油效果好）对氟吡甲禾灵的提取效果. 3种溶剂提取氟吡禾灵的回收率分别为94.6%、87.3%、90.5%，乙腈的提取效果最好，回收率差异显著（P<0.05），试验选择乙腈为提取溶剂.
氢氧化钠加入量 提取中加入碱性溶液使氟吡禾灵酯及共轭物水解为氟吡禾灵，试验考察加入1、1.5、2、2.5 mL的5 mol·L−1NaOH溶液的水解效果. 4种加入量的回收率分别为67.4%、78.3%、95.8%、96.0%，其中，2 mL和2.5 mL 的5 mol·L−1NaOH溶液的回收率均大于95%，回收率差异不显著（P>0.05），均能完全水解样品中的氟吡禾灵酯及共轭物，试验选择加入2 mL的5 mol·L−1NaOH.
提取方法 考察室温振荡30 min、40℃振荡30 min、室温超声30 min和40℃超声30 min等4种提取方法对氟吡甲禾灵的提取效果. 4种提取方法的回收率分别为82.9%、93.8%、85.5%和94.9%，在40℃振荡30 min和40℃超声30 min两种提取方法回收率均较高，回收率差异不显著（P>0.05）. 因超声提取操作简单，选择40℃超声30 min.
乙腈提取次数 考察乙腈提取一次和提取二次（每次均10 mL）的提取效果. 乙腈提取一次和提取两次的回收率分别为93.4%和94.1%，两种提取的回收率差异不显著（P>0.05）. 因提取一次所需溶剂少、提取时间短，选择10 mL乙腈提取一次，即待测溶液经离心分层后，直接将上清液进行净化.
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常用的基质分散固相萃取剂为C18、PSA和GCB. 将6 mL提取液加入预装有8种不同比例吸附剂的净化管中净化， 8种吸附剂组合分别为150 mgMgSO4+0 mg PSA +0 mg C18+0 mg GCB（A组）、150 mg MgSO4+100 mg PSA+0 mg C18+0 mg GCB（B组）、150 mg MgSO4+0 mg PSA +100 mg C18+0 mg GCB（C组）、150 mg MgSO4+0 mg PSA +0 mg C18+100 mg GCB（D组）、150 mg MgSO4+100 mg PSA +100 mg C18+0 mg GCB（E组）、150 mg MgSO4+0 mg PSA +100 mg C18+100 mg GCB（F组）、150 mg MgSO4+100 mg PSA +0 mg C18+100 mg GCB（G组）、150 mg MgSO4+100 mg PSA +100 mg C18+100 mg GCB（H组），每组重复3次，考察8种吸附剂组合对氟吡禾灵回收率的影响. 结果表明，8个组的氟吡禾灵平均回收率为82.6%、63.4%、94.3%、83.5%、59.4%、93.9%、64.1%和69.2%，其中C组和F组回收率与其余6个组差异显著（P<0.05），C组和F组回收率均大于90%，C组回收率与F组差异不显著（P>0.05）. 因此，试验选择150 mg MgSO4 +100 mg C18+100 mg GCB净化.
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在氟吡禾灵和D4-氟吡禾灵标准浓度均在 100 μg·L−1时，比较正离子模式和负离子模式下的响应值. 结果表明，氟吡禾灵和D4-氟吡禾灵在正离子模式下的响应值均大于负离子模式的响应值，试验选择在正离子模式下检测.
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将氟吡禾灵标准工作溶液注入液质联用仪中，以氟吡禾灵和D4-氟吡禾灵（0.05 μg·mL−1）峰面积比值为纵坐标（Y），以氟吡禾灵质量浓度为横坐标（X），绘制标准溶液工作曲线. 结果表明，氟吡禾灵在浓度为0.001 —0.500 μg·L−1范围内有良好的线性关系，其线性方程为Y=1.6821X-0.0051，相关系数0.9996. 氟吡禾灵、氟吡甲禾灵和D4-氟吡禾灵标准溶液色谱图信息见图1. 在阴性鸡蛋中加入一系列不同浓度的氟吡禾灵，每个浓度7次独立测试. 当样品中氟吡禾灵含量为0.003 mg·kg−1时信噪比（S/N）均大于3，确定方法检出限为0.003 mg·kg−1；以3倍检出限浓度为定量限，确定方法定量限为0.01 mg·kg−1.
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在鸡蛋和鹌鹑蛋样品中加入氟吡禾灵、氟吡甲禾灵标准溶液3个浓度水平（1倍定量限、3倍定量限、10倍定量限），混匀后按试验方法前处理和检测，获得本方法的回收率和精密度，结果见表3. 由表3可知，2种禽蛋样品中氟吡禾灵的回收率在93.7%—97.1%之间，精密度在2.3%—5.5%之间. 结果表明，本方法的回收率和精密度均满足GB/T 27404-2008分析要求.
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采用本试验方法检测市场上常见的5种禽蛋（鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽子蛋和鹌鹑蛋），共10个样品中的氟吡禾灵残留量. 10个样品均未检出氟吡禾灵残留量.
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本研究建立了分散固相萃取-同位素内标-液质联用法测定禽蛋中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量的方法. 优化了实验前处理步骤，以同位素内标法定量. 该方法具有操作简单、准确度高和精密度好等特点，适用于禽蛋样品中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量的检测.
分散固相萃取-同位素内标-液相色谱串联三重四极杆质谱法测定禽蛋中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量
Determination of haloxyfop, haloxyfop-esters and conjufates residue in eggs by liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry combined with dispersive solid phase extraction-isotope internal standard
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摘要: 通过优化禽蛋前处理方法，建立一种分散固相萃取-同位素内标-液相色谱串联三重四极杆质谱法测定水产品中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量方法. 称取5.0 g试样，用10 mL乙腈萃取，加氧化钠溶液水解氟吡禾灵酯成氟吡禾灵，经100 mgGCB和100 mgC18净化，取上清液，采用三重四极杆串联质谱正离子模式下的多反应监测检测，内标法定量. 研究结果表明，本方法中氟吡禾灵在0.001 —0.500 μg·L−1范围内具有良好的线性关系，相关系数0.9996，加标回收率93.7%—97.1%，检出限0.003 mg·kg−1，定量限0.010 mg·kg−1. 本方法具有前处理简单、灵敏度高等特点，适用于禽蛋中氟吡禾灵、氟吡禾灵酯及共轭物残留量的检测.
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关键词:
- 氟吡禾灵 /
- 禽蛋 /
- 液相色谱串联三重四极杆质谱法
Abstract: An analytical method was developed for the determination of haloxyfop, haloxyfop-esters and conjufates residue in eggs using LC-MS/MS combined with dispersive solid phase extraction-isotope internal standard. After 5.0 g aquatic product samples were extracted with 10 mL acetonitrile, the sodium hydroxide solution hydrolyzed haloxyfop-esters into haloxyfop. After purification by 100 mg GCB and 100 mg C18, the supernatant was detected by MRM under the positive ion mode of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and quantified by internal standard method. The method displayed good linearity in the concentration of haloxyfop ranged from 0.001 μg·L−1 to 0.500 μg·L−1 with the correlation coefficient of 0.9996, the average recoveries ranged from 93.7% to 97.1%, the limit of detection of 0.003 mg·kg−1 and the limit of quantification of 0.01 mg·kg−1. This method is fast, ensitivity and suitable for determination of haloxyfop, haloxyfop-esters and conjufates residue in eggs.-
Key words:
- haloxyfop /
- eggs /
- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
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图 1 氟吡禾灵、D4-氟吡禾灵和氟吡甲禾灵MRM色谱图
Figure 1. MRM Chromatogram of haloxyfop，D4-haloxyfop，haloxyfop-esters
表 1 液相色谱梯度洗脱程序
Table 1. Gradient elution procedures for liquid chromatography
时间/min 流速/（mL·min−1） 0.1 % 甲酸水溶液/% 乙腈/% 0.00 0.20 90 10 3.00 0.20 50 50 7.50 0.20 20 80 7.51 0.20 90 10 10.00 0.20 90 10 
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表 2 MRM参数
Table 2. MRM parameters
中文名 CAS号 监测离子对 Q1 入口电压/V CE Q3入口电压/V 氟吡禾灵 69806−34-4 362.20>316.05* −10.0 −19.0 −15.0 362.20>288.00 −11.0 −26.0 −20.0 362.20>91.10 −11.0 −30.0 −19.0 氟吡甲禾灵 69806−40-2 375.90>316.00* −16.0 −18.0 −21.0 375.90>287.90 −11.0 −25.0 −30.0 375.90>91.15 −15.0 −31.0 −17.0 D4−氟吡禾灵 127893−34-9 366.10>319.15* −11.0 −19.0 −15.0 366.10>317.60 −13.0 −21.0 −21.0 366.10>292.2 −15.0 −25.0 −21.0 注：*为定量离子对.
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表 3 方法的精密度及回收率试验结果（n=6）
Table 3. Results of tests for recovery and precision of the method
样品 添加0.01 mg·kg−1 添加0.03 mg·kg−1 添加0.10 mg·kg−1 回收率/% 相对标准偏差/% 回收率/% 相对标准偏差/% 回收率/% 相对标准偏差/% 鸡蛋 93.7 3.7 96.2 3.9 95.8 2.3 鹌鹑蛋 94.9 5.5 97.1 3.6 95.4 2.7
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