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四环素类抗生素（TCs）是由放线菌产生的一类广谱抗生素，广泛应用于医疗、畜牧、水产养殖等行业[1 − 2]. 常见的TCs有四环素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）等，其中TC由于使用领域广、成本低、抗菌效果好等优势，是目前使用最为广泛的抗生素之一[3]. 随着TC用量的增加，给环境生态、食品安全带来了一系列问题，严重威胁了人体健康. 畜牧业和水产养殖业中残留的TC会通过各种途径污染水环境，水环境中残留的TC会导致人体产生耐药性、肝脏损害等毒理效应[4]. 目前检测TC的方法主要有高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）[5 − 6]、酶联免疫法（ELISA）[7]、荧光法[8 − 9]、电化学法[10]等，虽然这些方法具有检出限低、选择性高、检测结果精确等优势，但是存在样品前处理过程复杂，需要专人操作，仪器价格高昂等问题[11 − 12]. 因此，亟需开发更加快速便捷的四环素检测方法.
纳米材料因独特的物理化学性质，在TC检测领域得到了广泛应用. 其中量子点（quantum dots，QDs）、碳点（carbon dots，CDs）等常用作荧光探针[13 − 14]，用于构建荧光法检测不同介质中TC残留，该类方法虽然具有灵敏度高的优点，但是QDs和CDs产率较低，且容易受到仪器、光源强度和环境温度等因素影响，在实际应用中存在一定的局限性. 金、银等贵金属纳米粒子常用作比色检测探针[15 − 16]，用以构建比色检测TC的方法，虽然检测过程有所简化，但是贵金属的成本问题在实际应用中不可忽视. 结合价格低廉，性能优异、具有类酶催化活性的复合纳米材料替代贵金属粒子成为优化比色检测方法的重要手段. 类酶活性的提高在构建便捷高效的基于纳米酶催化显色的比色检测方法中尤为重要. 相较于单一组分纳米酶，两种或多种组分纳米酶掺杂可以充分发挥纳米酶之间的协同效应并增强其类酶活性. Priyakshr等[17]构建了 CoS/p-rGO纳米复合材料，相比于CoS，CoS/p-rGO对TMB和H2O2的亲和力分别提升至1.4倍和2.3倍，反应速率提高至20倍. Liu等[18]合成的IrO2/rGO纳米复合材料，相较于单一组分，催化活性提升明显. 现今，基于复合材料纳米酶的检测应用主要集中在葡萄糖、抗坏血酸等生物小分子[19 − 20]，有机磷、氨基甲酸酯等农药[21 − 22]， Hg2+、Cr6+等重金属离子[23 − 24]，对于TC的检测应用还有待完善. 此外，传统比色法的结果主要是与光谱仪或分光光度计相结合进行定量分析[25 − 26]. 与分光光度计相比，智能手机由于高持有率和便携性成为定量颜色变化重要工具. 采用手机摄像头作为结果的获取工具，手机APP作为图像结果的分析工具，暗箱拍照装置作为结果获取时的防干扰工具，为进一步实现比色传感法的推广应用提供条件.
基于此，本文采用简单高温煅烧法制备NiS2@N,S-rGO复合材料纳米酶，NiS2纳米颗粒在N,S-rGO片层上实现均匀分散. 异质原子掺杂，碳层基底分散及不同材料组分间的协同作用，可有效地提高纳米酶的催化活性. 在H2O2存在的条件下，NiS2@ N,S-rGO纳米酶将无色TMB溶液快速氧化为蓝色oxTMB溶液. TC分子与N,S-rGO间存在的π-π共轭作用和与NiS2颗粒表面金属位点存在的较强络合倾向，可有效促进TC分子吸附在纳米酶表面并形成络合物，形成的络合物能够催化H2O2产生更多的活性氧自由基，进而使显色体系颜色变深[27-28]. 利用TC对该显色反应的促进机制，结合手机拍照装置和APP（Thing Identify）对显色图像数据进行采集和分析，建立一种简便快捷的智能可视化检测环境水体中TC的方法，对快速检测水体中环境污染物含量具有一定的推广应用价值.
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Ni（CH3COO）2·4H2O、硫代乙酰胺（TAA）、对苯醌（PBQ）、异丙醇（IPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇（EG）、醋酸（HAc）、二甲基亚砜（DMSO）、醋酸钠（NaAc）和TMB均购自阿拉丁（中国上海）. 四环素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）购自麦克林（中国上海）. 所有试剂均为分析纯，且在使用时未做进一步纯化. 超纯水（>18.2MΩ）是由Milli-Q梯度系统（贝德福德，MA，美国）产生的.
采用管式炉（OTF-
1200 ）煅烧所需的纳米材料；采用紫外可见光分光光度计（UV-5500PC）测量体系吸光度；采用扫描电子显微镜（SEM, Quanta 250）和透射电子显微镜（TEM,Tecnai F20）表征纳米酶形貌；采用X射线衍射仪（XRD，Rigaku SmartLab）测试晶体结构；采用拉曼光谱（Raman，LabRam HR Evolution）测试特征峰；采用X射线光电子能谱仪（XPS，Thermo Scientific K-Alpha）测试元素组成和形态. -
采用高温煅烧法制备NiS2@N,S-rGO纳米复合材料. 将31.1 mg Ni（CH3COO）2·4H2O和187.82 mg TAA溶解在5 mL EG中，在室温下磁力搅拌30 min，转速为500 r·min−1，从而得到均匀溶液a. 将20 mg rGO加入到2 mL EG，在超声条件下使其分散均匀，随后将所得悬浮液缓缓滴加到上述溶液a中. 将混合溶液转移至瓷舟中，在N2气氛下，以5 ℃·min−1的升温速率加热至300 ℃并保持60 min；待管式炉冷却至室温后，将煅烧后所得的材料从炉中取出并用去离子水和乙醇交替洗3次；最后将所得到的产物于60 ℃烘箱中干燥，最终得到深灰色产物.
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采用TMB为显色底物，进行了一系列比色反应，对NiS2@N,S-rGO的类过氧化物酶活性进行评价. 在
1700 μL HAc-NaAc缓冲溶液（pH=3.6）中，依次加入60 μL NiS2@N,S-rGO（1 mg·mL−1，超纯水稀释）、200 μL TMB（10 mmol·L−1，DMSO稀释）和40 μL H2O2（50 mmol·L−1，超纯水稀释），在30℃水浴孵育20 min后，用0.45 μm的混合纤维素过滤器过滤，记录反应溶液在652 nm处的吸光度值（A652）. -
在“NiS2@N,S-rGO+TMB+H2O2”催化显色体系中，对不同pH的HAc-NaAc缓冲溶液（3.2、3.6、4.0、4.6、5.0、6.0）及温度（20、30、40、50、60 ℃）进行条件优化，以确定最佳实验条件.
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为进一步研究NiS2@N,S-rGO的酶促反应稳态动力学，选择固定H2O2量（40 μL, 50 mmol·L−1），改变TMB浓度（0.2、0.4、0.6、1、2、4、6 mmol·L−1）或固定TMB量（200 μL，10 mmol·L−1），改变H2O2浓度（2、4、6、10、20、30、40、50 mmol·L−1），记录反应溶液在A652处的变化情况. 通过Michaelis-Menten方程拟合，得到了稳态动力学分析中的催化性能参数. Michaelis-Menten方程（1）描述了给定底物的转化率与酶的底物浓度之间的关系（本例中为NiS2@N,S-rGO）：
式中，Km为Michaelis常数，Vmax为最大反应速率，[S]为TMB浓度.
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通过活性自由基捕获实验对NiS2@N,S-rGO纳米酶催化底物TMB变为蓝色的反应机理进行探究. 通过文献调研发现，IPA、EDTA和PBQ分别具有清除羟基自由基（·OH）、电子空穴（h+）和超氧自由基（·O2−）的能力[29 − 30]. 在优化后的“NiS2@N,S-rGO+TMB+H2O2”显色体系中分别加入200 μL的自由基捕获剂. 在30℃下孵育20 min后，记录A652值.
生成的·OH、h+和·O2−使用自旋捕获加合物5,5′-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物（DMPO）通过EPR 光谱测定. ·OH和h+在HAc-NaAc缓冲液（0.2 mol·L−1，pH = 3.6）作为溶剂和浓度为1 mg·mL−1 NiS2@N,S-rGO的条件下进行检测. 在室温下保持光照5 min后，将溶液吸入石英毛细管中进行EPR分析. ·O2−的检测以甲醇为溶剂进行，其他操作与检测·OH和h+相同.
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以TC、CTC、OTC为研究对象，探究目标物浓度与显色体系的吸光度值变化关系. 以TC为例，在优化后的“NiS2@N,S-rGO+TMB+H2O2”显色体系中加入100 μL不同浓度（10—200 μmol·L−1）的TC. 在30℃下孵育20 min后，记录A652值. CTC、OTC的实验探究过程类似.
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以TC为四环素类抗生素的典型模型，对自来水中的TC进行分析. 检测前，先将自来水水样通过孔径为0.22 μm混合纤维素滤膜过滤进行预处理后，配置成不同浓度的TC水样（0、30、60 μmol·L−1），分别将100 μL水样加入反应体系内. 在30℃下孵育20 min后，记录A652值.
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为了方便地测定TC的浓度，借助智能手机的拍照和色值分析功能，课题组使用自研发的基于智能手机应用程序的检测平台（Thing Identify）. 在最优条件下，对加入不同浓度TC水样（10—100 μmol·L−1）的反应体系的结果进行色值分析，利用反应后颜色的灰度值与TC浓度间的线性关系实现智能可视化检测的应用.
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采用SEM和TEM对NiS2@N,S-rGO的微观形貌结构进行表征. SEM结果表明，NiS2纳米颗粒均匀分布在石墨烯片层基底表面，且片层立体无坍塌，颗粒大小约为10—20 nm（图1a）. TEM显示NiS2纳米颗粒在碳层表面密集堆积（图1b）. HRTEM观察到NiS2与N,S-rGO有清晰边界，有明显的晶格条纹，晶格间距0.28 nm对应于NiS2的（200）晶面（图1c）；晶格间距0.34 nm对应于碳材料的（002）晶面. TEM-mapping清晰显示了C、N、Ni、S元素均匀分布在NiS2@N,S-rGO纳米酶表面（图1d），C、N、Ni、S原子百分比分别为80%、1.2%、5.9%、12%，其中Ni/S原子个数比小于理论值1/2，主要是因为硫元素除了存在于NiS2纳米颗粒中还被成功掺杂于石墨烯片层中. 采用XRD测试对NiS2@N,S-rGO纳米复合材料的晶体结构进行分析（图1e），NiS2@N,S-rGO材料的衍射峰集中在27.14°、31.44°、35.26°、38.75°、45.05°、47.95°、53.39°、58.47°、60.90°，分别对应于（111）、（200）、（210）、（211）、（220）、（311）、（023）和（321）晶面，与立方相NiS2的标准卡片（PDF#89-
7142 ）相匹配. 20°左右的宽峰对应于石墨烯的（002）晶面. 通过电镜和XRD的分析，成功证明了NiS2@N,S-rGO纳米酶的合成，并且N、S掺杂的石墨烯片层上均匀分布的NiS2纳米颗粒可以提供更丰富的活性位点，从而提高纳米酶的催化活性.如图2a拉曼光谱结果所示，NiS2@N,S-rGO复合材料在
1348 cm−1（D带）和1587 cm−1（G带）处出现两个特征峰，D/G峰强度比（ID/IG）为1.02，说明复合材料中具有丰富的缺陷位点，可以加快催化反应体系中电子之间的转移. 通过XPS对NiS2@N,S-rGO材料表面的元素价态进一步分析发现，合成的纳米材料主要由Ni、S、C、O和N元素组成（图2b）. 对C 1s轨道进行分峰拟合（图2c），在284.8 eV、285.0 eV、286.8 eV和288.7 eV处的特征峰分别对应于C—C、C—N、C—S和C=O[31]. 对N 1s轨道进行分峰拟合所得的特征峰出现在401.1 eV、400.4 eV和399.4 eV处，说明了石墨N、吡咯N和吡啶N的存在[32]（图2d）. 吡咯N和吡啶N可以锚定金属组分形成更多的活性位点，石墨N则可以改变原子和电子结构，提高催化氧化活性[33]. 在Ni 2p轨道的分峰，可以观察到两组自旋轨道双峰（图2e）. 在878.9 eV和861.7 eV分别对应于Ni2+2p3/2和Ni2+2p1/2，874.3 eV和856.4 eV分别对应于Ni3+2p3/2和Ni3+2p1/2，870.7 eV和853.0 eV归因于Ni的两个卫星峰[34]. 混合价态的Ni有利于提高催化活性和选择性. 在S 2p轨道的分峰中（图2f），161.4 eV和162.5 eV特征峰分别对应于S 2p3/2和S 2p1/2，163.7 eV和165.8 eV分别对应于S2-和C—S，169.3eV处的峰归因于对应于SO42-[35]. -
为了探究NiS2@N,S-rGO类酶活性，选择了TMB作为显色底物来衡量催化性能. 如图3所示，当溶液仅有TMB时，溶液呈无色，且无特征吸收峰；当同时加入TMB和H2O2时（TMB+H2O2），溶液由无色变为淡蓝色，出现微弱特征吸收峰（A652=0.54），这可能是由于H2O2自身的氧化性引起的底物颜色的变化；当同时加入NiS2@N,S-rGO、TMB和H2O2时（NiS2@N,S-rGO+TMB+H2O2），溶液由无色变为深蓝色，出现明显特征吸收峰（A652=1.11）. 以上结果表明，NiS2@N,S-rGO纳米材料具有优异的类过氧化物酶活性，可以作为类过氧化物纳米酶催化“TMB+H2O2”溶液显色. NiS2@N,S-rGO优异的催化活性主要可能来自于NiS2颗粒的尺寸效应，细小的纳米颗粒与氮硫共掺杂碳材料间的协同作用，促进了催化反应中的电子转移，增强了纳米酶和显色底物之间的相互作用，进而有效地提升了催化效果.
通常情况下，纳米酶的催化活性与体系的pH和孵育温度关系密切，因此进一步探究了不同pH和孵育温度条件下，NiS2@N,S-rGO纳米酶催化活性的变化. 如图4a所示，当pH在3.2—6范围内，A652呈现出先升高后降低的趋势，且在pH=3.6时达到最大值（A652=1.36）；当pH=6时，A652值接近于0，NiS2@N,S-rGO纳米酶表现出极低的催化活性，上述结果说明NiS2@N,S-rGO纳米酶在酸性条件中催化活性更高. TMB在水中的溶解度有限，具有较强的酸依赖性，在弱酸环境中，底物氨基的质子化可增加其溶解性[36]. 然而，pH值的过度降低导致两个氨基的质子化，并且使底物不易受催化氧化，这解释了酶活性明显降低的现象. 如图4b所示，当温度在20—60 ℃范围内，A652呈现先升高再降低的趋势，在30 ℃时该体系的A652值达到最高（A652=1.72），催化活性达到最大. 温度对纳米酶和底物TMB都具有较大的影响，温度过低会减缓酶催化反应的速率，同时减慢了底物分子的运动速率，降低了纳米酶与底物之间的碰撞频率；温度过高则会降低纳米酶的稳定性，并且导致底物TMB的分解或变性. 因此，选择pH=3.6，孵育温度30 ℃作为最佳催化反应条件.
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在最优实验条件下，分析了NiS2@N,S-rGO在不同浓度TMB（0.2—6.0 mmol·L−1）和H2O2（2.0—50 mmol·L−1）的作用下的稳态动力学参数. 米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）根据Lineweaver-Burk计算得到（图5）. 表1显示，TMB和H2O2的Km值分别为0.517 mmol·L−1和1.318 mmol·L−1. Km值越低，表示纳米酶与底物之间的亲和力越高，与H2O2相比，NiS2@N,S-rGO纳米酶更倾向于与TMB结合. 将NiS2@N,S-rGO的稳态动力学参数与其它类似纳米酶的参数进行比较，NiS2@N,S-rGO纳米酶对于TMB的Km值低于其他类似纳米酶[37 − 39]，略高于HRP[40]，但其对于H2O2的Km值明显低于HRP. NiS2@N,S-rGO复合纳米酶与其他单体纳米酶相比，对底物具有较高的亲和力，因此催化活性更高，再次验证了复合纳米酶优于同类型单体纳米酶. 最大反应速率与同类纳米酶结果接近，但均低于天然HRP的反应速率，在克服天然酶制备成本高、保存条件苛刻问题的前提下，进一步开发活性接近甚至优于天然酶的纳米酶是研究者们要努力的方向.
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为了探究NiS2@N,S-rGO纳米酶在有H2O2存在时，催化TMB显色的反应机理，选择EDTA、IPA和PBQ三种清除剂分别验证h+，·OH 和·O2−的存在[27 − 28]. NiS2@N,S-rGO体系在加入捕获剂后在652 nm处的紫外吸光强度均有降低（图6a）. 其中，在加入IPA后，显色体系的A652值与不加清除剂相比只有轻微下降（ΔA652=0.11），这表明有少量·OH参与了催化反应；在加入PBQ后，显色体系的A652值明显下降（ΔA652=0.69），表明·O2−也参与了催化反应；加入EDTA后比色体系在652 nm处的紫外吸光度值几乎降至0（ΔA652=0.92），这表明h+在催化反应中起主导作用. 基于NiS2@N,S-rGO催化体系中自由基参与的存在进一步通过EPR分析推断. 如图6b-d所示， h+、·OH和·O2−具有清晰的信号，h+相比于·OH 和·O2−信号更明显，进一步证实h+在催化反应中起主导作用.
基于以上分析，可以推断NiS2@N,S-rGO纳米酶的催化机理：基底石墨烯具有独特的片层结构，可通过π-π相互作用将TMB分子吸附在纳米复合材料表面；表面具有混合化学价态超细NiS2颗粒和碳层表面的N、S杂原子共掺杂可为反应提供丰富的活性位点，有利于催化效率的提升；通常情况下，在可见光照射下，晶体材料如金属氧化物或硫化物会发生价带跃迁，产生价带空穴[41]，NiS2@N,S-rGO纳米酶的电子（e−）从价带（VB）跃迁至导带（CB），并在VB产生相应的h+；在e−的参与下，H2O2被分解为·OH和·O2−，从而催化氧化TMB为oxTMB，溶液呈现蓝色.
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在最优条件下，通过加入不同浓度的TC，构建比色检测方法，记录A652值的变化，实现对TC的定量检测. 将一系列浓度的TC加入反应体系后（10—200 μmol·L−1），A652随着TC浓度的增加而增加，溶液也由淡蓝色变为深蓝色（图7a）. TC在10—100 μmol·L−1浓度范围内与A652值呈良好的线性关系（图7b），线性回归方程为y=
0.00837 x+0.72569 （R2=0.9950 ），检出限为3.06 μmol·L−1（S/N=3）. 为了进一步验证比色传感器的广泛应用和可靠性，将其应用于CTC和OTC的测定. 对于CTC浓度在线性范围10—100 μmol·L−1内与A652值呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.00656 x+0.87327 （R2=0.9814 ），检出限为3.37 μmol·L−1（S/N=3）（图7c）. 对于OTC浓度在线性范围10—100 μmol·L−1内与A652值呈良好的线性关系，线性回归方程y=0.00542 x+1.21643 （R2=0.9930 ），检出限为3.66 μmol·L−1（S/N=3）（图7d）. 构建的比色方法成功用于三种TCs的检测，并与其他检测TC方法进行比较（表2）. 该方法检出限略低于同类型比色法，但线性范围更宽，且线性范围和检出限与电化学法和荧光法相比相差不大，虽不如HPLC和ELISA，但比色法更加快速便捷.为了评估开发的比色系统对TCs的选择性和TC的抗干扰能力，选择金属阳离子（Hg2+、Pb2+、As3+、Se6+、Mg2+、K+、Cu2+、Ca2+）、阴离子（NO2−、PO43-）、有机物（尿酸（UA）、抗坏血酸（AA）、L-半胱氨酸（L-Cys）、谷胱甘肽（GSH））和抗生素（红霉素（EM）、头孢噻肟（CTX））作为干扰物质. TC、CTC、OTC的浓度为1 mmol·L−1，其他干扰物浓度为10 mmol·L−1. 如图8a所示，TC、CTC、OTC的A652值分别为2.2、1.9和2.1，明显高于其他干扰物质. 如图8b所示，当TC与干扰物质共存时，A652值相差不大，干扰物质对识别TC没有显著影响. 因此NiS2@N,S-rGO纳米酶对TCs具有较好的选择性，开发的比色系统对TC具有较好的抗干扰能力.
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选择TC作为TCs的代表性物质. 在对基于NiS2@N,S-rGO纳米催化显色的比色方法进行实验条件的优化和验证后，结合智能手机拍照和软件App处理显色结果图片的功能，依据TC浓度值与显色结果的灰度值之间的线性关系来实现实际水样中TC的定量检测. TC浓度在10—100 μmol·L−1范围内，颜色的灰度值与TC浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=-2.471x+362.554（R2=0.982），检出限（LOD）是3.3 μmol·L−1. 将该智能手机软件检测TC浓度的方法与实验室比色检测TC检测结果进行比较，发现APP检测法中实际水样的TC浓度的相对回收率为80.27%—129.67%（表3）.
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本文通过高温煅烧法成功将NiS2纳米颗粒均匀负载在石墨烯片层上，制备了具有优异类过氧化物酶活性的NiS2@N,S-rGO复合纳米酶. NiS2纳米颗粒和氮、硫掺杂石墨烯之间的协同效应提高了纳米酶的催化活性. 基于TCs对“NiS2@N,S-rGO纳米酶+TMB+H2O2”显色体系的促进作用，构建了比色检测TCs的方法. 此外，以TC作为污染物代表，结合智能手机拍照功能和手机APP的灰度值分析功能构建了快速便捷的智能手机可视化检测TC方法，并成功应用于自来水样品中TC含量检测. 将智能手机可视化与新兴纳米酶显色比色法相结合，用以建立具有快速便捷和即时检测等优点的新型TCs检测方法具有较大的应用潜能.
基于NiS2@N,S-rGO纳米酶的智能手机辅助比色传感平台的构建及四环素可视化检测
Construction of smartphone-based colorimetric sensing platform and visual detection of tetracyclines based on NiS2@N,S-rGO nanozyme
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摘要: 近年来，利用纳米酶与显色底物作用构建比色传感平台用于水环境污染物检测成为研究热点. 本研究采用简单高温煅烧法制备了均匀负载的NiS2@N，S-rGO复合纳米材料，并通过一系列表征技术系统研究了其形貌、结构特征以及类酶活性作用机制. 结果表明，NiS2@N，S-rGO具有优异的类过氧化物酶活性，在有H2O2存在时，可以将无色的显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色氧化产物（oxTMB），且在652 nm处产生特定可见吸收峰. 选择四环素(TC)、金霉素(CTC)和土霉素(OTC)等3种常用抗生素作为研究对象，结合四环素类（TCs）对“ NiS2@N，S-rGO+H2O2+TMB ”比色传感体系显色效果的促进作用，利用吸光度值与TCs浓度的线性关系来实现目标物的快速比色检测. 最后，以TC为应用对象，结合智能手机拍照装置和APP（thing identify）对显色图像结果进行采集和处理，实现TC的智能可视化比色检测方法的构建. 该方法的线性范围为10—100 μmol·L−1，检出限为3.3 μmol·L−1，能成功应用于自来水中TC的检测，相对回收率为80.27%—129.67%.Abstract: In recent years, the engineering and development of colorimetric sensing platforms for detecting pollutants in environmental waters through interactions between nanozymes and chromogenic substrates has emerged as a prominent research field. In this study, we have successfully synthesized uniformly loaded NiS2@N,S-rGO nanocomposites using a facile high-temperature calcination approach. The morphological and structural characteristics, as well as the enzyme-like activity of the prepared nanocomposites, were thoroughly analyzed through a series of characterization techniques. The NiS2@N,S-rGO nanocomposites exhibited exceptional peroxidase-like activity and demonstrated their ability to oxidize the colorless chromogenic substrate 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) to produce a blue oxidation product (oxTMB) in the presence of H2O2 with strong absorption peaks at 652 nm. Tetracycline (TC), chlortetracycline (CTC), and oxytetracycline (OTC) were selected as target analytes due to their enhanced effects on the “NiS2@N,S-rGO+H2O2+TMB” colorimetric sensing system. A satisfactory linear relationship was established between optical absorbance values at 652 nm and TC concentrations for accurate colorimetric detection purposes. Finally, we developed an intelligent smartphone-based sensing assay for TC detection by integrating the smartphone's image-acquiring function with the "Thing Identify" APP software. Consequently, the developed method exhibited a linear range from 10—100 μmol·L−1 and achieved an impressive detection limit of 3.3 μmol·L−1. Ultimately, this newly developed method was successfully applied for determining TCs in tap water with relative recoveries ranging from 80.27% to 129.67%.
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图 1 NiS2@N,S-rGO的（a）SEM图（内嵌图：粒径分布图）；（b）TEM图；（c）HRTEM图；（d）TEM-mapping图和（e）XRD图
Figure 1. （a） SEM image （Insert image: size distribution）; （b） TEM image; （c） HRTEM image; （d） TEM-mapping images and （e） XRD of NiS2@N,S-rGO
图 2 NiS2@N,S-rGO的（a）Raman图；（b）XPS全谱图和（c-f）XPS光谱
Figure 2. （a）Raman spectra; （b） XPS survey spectra and XPS spectra （c-f） for NiS2@N,S-rGO
图 3 NiS2@N,S-rGO类氧化物酶的紫外-可见光吸收光谱图
Figure 3. UV-vis absorption spectra of NiS2@N,S-rGO for oxidase-like activity
图 4 （a）pH和（b）温度对NiS2@N,S-rGO纳米酶活性的影响
Figure 4. The effects of reaction conditions on the oxidase-like activity of NiS2@N,S-rGO: （a） pH and （b） temperature
图 5 NiS2@N,S-rGO与不同浓度的（a）TMB和（c）H2O2的稳态动力学分析；（b）TMB和（d）H2O2对应的Lineweaver-Burk曲线
Figure 5. Michaelis-Menten plots of NiS2@N,S-rGO fitted for different concentrations of （a） TMB and （c） H2O2; The associated Lineweaver-Burk plots for （b） TMB and （d） H2O2
图 6 （a）NiS2@N,S-rGO在不同自由基清除剂存在下对TMB催化作用的影响；（b，c和d）NiS2@N,S-rGO的EPR光谱
Figure 6. （a） The presence of different free radical scavengers influences the catalytic effect of TMB in the presence of NiS2@N,S-rGO on active scavengers; （b, c and d） EPR spectra of NiS2@N,S-rGO
图 7 （a）不同浓度TC的紫外可见吸收光谱；（b）A652与TC浓度的关系图（内嵌图：TC浓度在10—100 μmol·L−1范围内的标准曲线）；（c）A652与CTC浓度的关系图（内嵌图：CTC浓度在10—100 μmol·L−1范围内的标准曲线）；（d）A652与OTC浓度的关系图（内嵌图：OTC浓度在10—100 μmol·L−1范围内的标准曲线）
Figure 7. （a） UV-vis absorption spectra of different concentrations of TC; （b） Relationship diagram between A652 and TC concentration （Insert image: standard curve of TC concentration in the range of 10—100 μmol·L−1）; （c） Relationship between A652 and CTC concentration （Insert image: standard curve of CTC concentration in the range of 10—100 μmol·L−1）; （d） Relationship diagram between A652 and OTC concentration （Insert image: standard curve of OTC concentration in the range of 10—100 μmol·L−1）
图 8 比色系统对（a）TCs的选择性和（b）TC的抗干扰能力
Figure 8. The colorimetric system has （a） selectivity to TCs and （b） anti-interference capability to TC
表 1 不同纳米酶催化动力学参数比较
Table 1. Comparison of Michaelis-Menten constants of different nanozymes
催化剂
CatalystKm/ （mmol·L−1） Vmax/ （×10−8 mol·L−1·s−1） 参考文献
ReferencesTMB H2O2 TMB H2O2 GO 0.86 16.69 4.3 2.27 [37] N-rGO 0.998 7 5 4.5 [38] NiS 0.543 0.272 2.96 2.46 [39] HRP 0.434 3.7 10 8.71 [40] NiS2@N,S-rGO 0.517 1.318 2.72 2.64 本文 注：GO，氧化石墨烯；N-rGO，N掺杂石墨烯；HRP，辣根过氧化物酶；Km，Michaelis常数；Vmax，最大反应速率 Notes: GO，graphene oxide；N-rGO，N-doped graphene oxide；HRP，horseradish peroxidase；Km，Michaelis constant；Vmax，the maximum reaction rate 
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表 2 不同方法检测TC的比较
Table 2. Comparison of different methods for detecting TC
催化剂
Catalyst方法
Method物质
Substance线性范围/ （μmol·L−1）
Linear range检出限/ （μmol·L−1）
Detection limit参考文献
ReferencesCu-MOF 比色法 TC 0.1—0.7 0.23 [42] ND-MS/GCE 电化学法 TC 5—180 2.0 [43] ERGO-SPE 电化学法 TC 20—80 12 [44] CDs 荧光法 TC 10—400 6 [45] ZnS:Cu QDs 荧光法 TC 0.2—2 0.149 [46] — 高效液相法 TC 0.23—45 0.12 [47] — 酶联免疫法 TC 2.25×10−5—2.25 18.01×10−5 [48] （Fe/Co）MIL-101 比色法 TC 1—8 0.26 [49] NiS2@N,S-rGO 比色法 TC 10—100 3.06 本文 CTC 10—100 3.37 本文 OTC 10—100 3.66 本文 注：MXene，2D材料；ND-MS/GCE，纳米金刚石基木薯淀粉生物膜的改性玻碳电极；ERGO-SPE，电化学还原氧化石墨烯/丝网印刷电极；CDs，碳量子点；ZnS:Cu QDs，铜掺杂硫化锌量子点 Notes：MXene，2D material；ND-MS/GCE，a modified glassy carbon electrode with a nanodiamond-based and manioc starch biofilm；ERGO-SPE，electrochemically reduced graphene oxide-based / screen-printed electrodes；CDs，carbon quantum dots；ZnS:Cu QDs，copper-doped zinc sulfide quantum dots
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表 3 自来水中TC浓度的检测
Table 3. Detection of TC concentration in running water
样品
Samples加标量 （μmol·L−1）
Added紫外-可见光谱法
UV-Vis Spectroscopy手机可视化比色法
Smartphone-based colorimetric method检测/ （μmol·L−1）
Detection回收率/ %
Recovery检测/ （μmol·L−1）
Detection回收率/ %
Recovery自来水 1 0 — — — — 30 32.43 108.10 38.90 129.67 60 62.17 103.62 63.37 105.62 自来水 2 0 — — — — 30 28.78 95.93 24.08 80.27 60 60.87 101.45 55.93 93.22 自来水 3 0 — — — — 30 31.25 105.00 36.43 121.43 60 61.37 102.28 60.52 100.87
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[1] AMANGELSIN Y, SEMENOVA Y, DADAR M, et al. The impact of tetracycline pollution on the aquatic environment and removal strategies[J]. Antibiotics, 2023, 12(3): 440. doi: 10.3390/antibiotics12030440 [2] CHEN Y R, XIA Y D, LIU Y W, et al. Colorimetric and electrochemical detection platforms for tetracycline based on surface molecularly imprinted polyionic liquid on Mn3O4 nanozyme[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2022, 216: 114650. [3] 李伟明, 鲍艳宇, 周启星. 四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J]. 应用生态学报, 2012, 23(8): 2300-2308. LI W M, BAO Y Y, ZHOU Q X. Degradation pathways and main degradation products of tetracycline antibiotics: Research progress[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(8): 2300-2308 (in Chinese).
[4] MO M J, WANG X S, YE L Y, et al. A simple paper-based ratiometric luminescent sensor for tetracyclines using copper nanocluster-europium hybrid nanoprobes[J]. Analytica Chimica Acta, 2022, 1190: 339257. doi: 10.1016/j.aca.2021.339257 [5] 黄梦凡, 李敏, 刘娟, 等. 地表水中20种四环素类抗生素及其转化产物的同时检测方法研究和应用[J]. 环境化学, 2024, 43(7): 2194-2205. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023020601 HUANG M F, LI M, LIU J, et al. Research and application of simultaneous detection method for 20 tetracyclines and transformation products in surface water[J]. Environmental Chemistry, 2024, 43(7): 2194-2205(in Chinese). doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2023020601
[6] 赵琪. 高效液相色谱质谱联用法在食品中四环素类药物残留检测中的应用[J]. 食品安全导刊, 2022(20): 82-84,88. doi: 10.3969/j.issn.1674-0270.2022.20.spaqdk202220037 ZHAO Q. Application of high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry in the detection of tetracycline residues in food[J]. China Food Safety Magazine, 2022(20): 82-84,88 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1674-0270.2022.20.spaqdk202220037
[7] 邓波, 朱卫芳, 周雨璊, 等. 胶体金免疫层析法快速检测肉类中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄残留的应用验证研究[J]. 农产品质量与安全, 2023(1): 89-93. doi: 10.3969/j.issn.1674-8255.2023.01.017 DENG B, ZHU W F, ZHOU Y M, et al. Application of colloidal gold immunochromatography for rapid detection of enrofloxacin, tetracycline and cefalexin residues in meat[J]. Quality and Safety of Agro-Products, 2023(1): 89-93 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1674-8255.2023.01.017
[8] 陈文静, 李明, 林洪, 等. 生物质衍生荧光碳点高灵敏检测环境水样中四环素[J]. 分析科学学报, 2023, 39(1): 21-26. CHEN W J, LI M, LIN H, et al. Highly sensitive detection of tetracycline in environmental water samples by biomass-derived fluorescence carbon dots[J]. Journal of Analytical Science, 2023, 39(1): 21-26 (in Chinese).
[9] 杨杰, 杨学山, 马晓彤. 微波法制备荧光碳量子点及其对牛奶中四环素的快速检测[J]. 食品与发酵科技, 2022, 58(5): 111-117,141. YANG J, YANG X S, MA X T. Microwave method for the preparation of fluorescent carbon quantum dots and their rapid detection of tetracycline in milk[J]. Food and Fermentation Sciences & Technology, 2022, 58(5): 111-117,141 (in Chinese).
[10] MOHAMMAD-RAZDARI A, GHASEMI-VARNAMKHASTI M, ROSTAMI S, et al. Development of an electrochemical biosensor for impedimetric detection of tetracycline in milk[J]. Journal of Food Science and Technology, 2020, 57(12): 4697-4706. doi: 10.1007/s13197-020-04506-2 [11] CHEN Y, ZHANG Y, LYU T T, et al. A facile strategy for the synthesis of water-soluble fluorescent nonconjugated polymer dots and their application in tetracycline detection[J]. Journal of Materials Chemistry C, 2019, 7(30): 9241-9247. doi: 10.1039/C9TC02738F [12] 席书敏, 王丁, 赵仁勇. 基于纳米酶构建比色生物传感器用于总抗氧化能力分析[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2023, 44(5): 41-50. XI S M, WANG D, ZHAO R Y. Construction of a colorimetric biosensor based on nanozyme for sensitive detection of total antioxidant capacity[J]. Journal of Henan University of Technology (Natural Science Edition), 2023, 44(5): 41-50 (in Chinese).
[13] HU D J, JIANG S Z, XIA T H, et al. Enhanced fluorescence sensing of tetracycline with Ti2C quantum dots[J]. Nano Research, 2024, 17: 3180-3188. doi: 10.1007/s12274-023-6134-8 [14] TANG X M, WANG L S, YE H, et al. Biological matrix-derived carbon quantum dots: Highly selective detection of tetracyclines[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2022, 424: 113653. doi: 10.1016/j.jphotochem.2021.113653 [15] SHEN L, CHEN J, LI N, et al. Rapid colorimetric sensing of tetracycline antibiotics with in situ growth of gold nanoparticles[J]. Analytica Chimica Acta, 2014, 839: 83-90. doi: 10.1016/j.aca.2014.05.021 [16] LIU D M, HUANG P C, WU F Y. Highly specific and rapid colorimetric detection of tetracycline in pills and milk based on aptamer-controlled aggregation of silver nanoparticles[J]. Chemistry Africa, 2022, 5(1): 107-114. doi: 10.1007/s42250-021-00286-0 [17] BORTHAKUR P, DARABDHARA G, DAS M, et al. Solvothermal synthesis of CoS/reduced porous graphene oxide nanocomposite for selective colorimetric detection of Hg(II) ion in aqueous medium[J]. Sensors and Actuators B-Chemical, 2017, 244: 684-692. doi: 10.1016/j.snb.2016.12.148 [18] LIU X L, WANG X H, HAN Q S, et al. Facile synthesis of IrO2/rGO nanocomposites with high peroxidase-like activity for sensitive colorimetric detection of low weight biothiols[J]. Talanta, 2019, 203: 227-234. doi: 10.1016/j.talanta.2019.05.070 [19] ZHANG X Z, ZHOU Y, ZHANG W, et al. Polystyrene@Au@prussian blue nanocomposites with enzyme-like activity and their application in glucose detection[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2016, 490: 291-299. [20] WU P, HUANG Y F, ZHAO X L, et al. MnFe2O4/MoS2 nanocomposite as Oxidase-like for electrochemical simultaneous detection of ascorbic acid, dopamine and uric acid[J]. Microchemical Journal, 2022, 181: 107780. doi: 10.1016/j.microc.2022.107780 [21] MA L, HE Y, WANG Y R, et al. Nanocomposites of Pt nanoparticles anchored on UiO66-NH2 as carriers to construct acetylcholinesterase biosensors for organophosphorus pesticide detection[J]. Electrochimica Acta, 2019, 318: 525-533. doi: 10.1016/j.electacta.2019.06.110 [22] YAN X, KONG D S, JIN R, et al. Fluorometric and colorimetric analysis of carbamate pesticide via enzyme-triggered decomposition of Gold nanoclusters-anchored MnO2 nanocomposite[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2019, 290: 640-647. doi: 10.1016/j.snb.2019.04.045 [23] GUO Y, TAO Y C, MA X W, et al. A dual colorimetric and SERS detection of Hg2+ based on the stimulus of intrinsic oxidase-like catalytic activity of Ag-CoFe2O4/reduced graphene oxide nanocomposites[J]. Chemical Engineering Journal, 2018, 350: 120-130. doi: 10.1016/j.cej.2018.05.135 [24] GUO X J, YANG F, JING L, et al. In-situ generation of highly active and four-in-one CoFe2O4/H2PPOP nanozyme: Mechanism and its application for fast colorimetric detection of Cr (VI)[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 431: 128621. doi: 10.1016/j.jhazmat.2022.128621 [25] FAN Y Y, LI J W, GUO Y P, et al. Digital image colorimetry on smartphone for chemical analysis: A review[J]. Measurement, 2021, 171(1): 108829. [26] LU W J, GUO Y J, YUE Y F, et al. Smartphone-assisted colorimetric sensing platform based on molybdenum-doped carbon dots nanozyme for visual monitoring of ampicillin[J]. Chemical Engineering Journal, 2023, 468: 143615. doi: 10.1016/j.cej.2023.143615 [27] WANG Z Y, DUAN L, ZHU D Q, et al. Effects of Cu(II) and Ni(II) ions on adsorption of tetracycline to functionalized carbon nanotubes[J]. Journal of Zhejiang University SCIENCE A, 2014, 15(8): 653-661. doi: 10.1631/jzus.A1400108 [28] 杨翔昊, 郭威, 孙翠竹, 等. 基于部分碳化NH2-MIL-101(Fe)的水中四环素类抗生素比色检测方法研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2023, 53(2): 116-124. YANG X H, GUO W, SUN C Z, et al. A colorimetric method based on porous carbon from NH2-MIL-101(Fe)for detection of tetracyclines in water[J]. Periodical of Ocean University of China, 2023, 53(2): 116-124 (in Chinese).
[29] LUO L P, OU Y, YANG Y, et al. Rational construction of a robust metal-organic framework nanozyme with dual-metal active sites for colorimetric detection of organophosphorus pesticides[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 423(Pt B): 127253. [30] LUO L P, HUANG L J, LIU X N, et al. Mixed-valence Ce-BPyDC metal-organic framework with dual enzyme-like activities for colorimetric biosensing[J]. Inorganic Chemistry, 2019, 58(17): 11382-11388. doi: 10.1021/acs.inorgchem.9b00661 [31] LV J M, BAI D X, YANG L, et al. Bimetallic sulfide nanoparticles confined by dual-carbon nanostructures as anodes for lithium-/ sodium-ion batteries[J]. Chemical Communications, 2018, 54(64): 8909-8912. doi: 10.1039/C8CC04318C [32] YE H Z, DING Y L, LIU T T, et al. Colorimetric assay based on NiCo2S4@N, S-rGO nanozyme for sensitive detection of H2O2 and glucose in serum and urine samples[J]. RSC Advances, 2022, 12(32): 20838-20849. doi: 10.1039/D2RA03444A [33] LIN D L, WU S Z, CHU S S, et al. Cobalt-nitrogen Co-doped carbon as highly efficient oxidase mimics for colorimetric assay of nitrite[J]. Biosensors, 2023, 13(7): 748. doi: 10.3390/bios13070748 [34] DONG X F, CHEN F J, CHEN G G, et al. NiS2 nanodots on N, S-doped graphene synthesized via interlayer confinement for enhanced lithium-/ sodium-ion storage[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2022, 619: 359-368. doi: 10.1016/j.jcis.2022.03.131 [35] LIU H, XU C Y, DU Y, et al. Ultrathin Co9S8 nanosheets vertically aligned on N, S/rGO for low voltage electrolytic water in alkaline media[J]. Scientific Reports, 2019, 9: 1951. doi: 10.1038/s41598-018-35831-4 [36] DROZD M, PIETRZAK M, PARZUCHOWSKI P G, et al. Pitfalls and capabilities of various hydrogen donors in evaluation of peroxidase-like activity of gold nanoparticles[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(29): 8505-8513. doi: 10.1007/s00216-016-9976-z [37] CHU S N, HUANG W, SHEN F Z, et al. Graphene oxide-based colorimetric detection of organophosphorus pesticides via a multi-enzyme cascade reaction[J]. Nanoscale, 2020, 12(10): 5829-5833. doi: 10.1039/C9NR10862A [38] NEKOUEI F, NEKOUEI S, JASHNSAZ O, et al. Green approach for in situ growth of highly-ordered 3D flower-like CuS hollow nanospheres decorated on nitrogen and sulfur Co-doped graphene bionanocomposite with enhanced peroxidase-like catalytic activity performance for colorimetric biosensing of glucose[J]. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications, 2018, 90: 576-588. [39] BORTHAKUR P, BORUAH P K, DAS M R. CuS and NiS nanoparticle-decorated porous-reduced graphene oxide sheets as efficient peroxidase nanozymes for easy colorimetric detection of Hg(II) ions in a water medium and using a paper strip[J]. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, 2021, 9(39): 13245-13255. [40] GAO L Z, ZHUANG J, NIE L, et al. Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles[J]. Nature Nanotechnology, 2007, 2: 577-583. doi: 10.1038/nnano.2007.260 [41] CHEN X H, CHOING S N, ASCHAFFENBURG D J, et al. The formation time of Ti-O• and Ti-O•-Ti radicals at the n-SrTiO3/aqueous interface during photocatalytic water oxidation[J]. Journal of the American Chemical Society, 2017, 139(5): 1830-1841. doi: 10.1021/jacs.6b09550 [42] NEHRA M, KUMAR R, DILBAGHI N, et al. Controlled synthesis of Cu-MOF possessing peroxidase-mimetic activity for the colorimetric detection of tetracycline in aqueous solution[J]. New Journal of Chemistry, 2023, 47(16): 7595-7603. doi: 10.1039/D3NJ00218G [43] FERNANDES-JUNIOR W S, ZACCARIN L F, OLIVEIRA G G, et al. Electrochemical sensor based on nanodiamonds and manioc starch for detection of tetracycline[J]. Journal of Sensors, 2021, 2021: 6622612. [44] LORENZETTI A S, SIERRA T, DOMINI C E, et al. Electrochemically reduced graphene oxide-based screen-printed electrodes for total tetracycline determination by adsorptive transfer stripping differential pulse voltammetry[J]. Sensors, 2019, 20(1): 76. doi: 10.3390/s20010076 [45] YAN Y, LIU J H, LI R S, et al. Carbon dots synthesized at room temperature for detection of tetracycline hydrochloride[J]. Analytica Chimica Acta, 2019, 1063: 144-151. doi: 10.1016/j.aca.2019.02.047 [46] ZHANG J, BAO Z J, QIAN J J, et al. Copper doped zinc sulfide quantum dots as ratiometric fluorescent probes for rapid and specific detection of tetracycline residues in milk[J]. Analytica Chimica Acta, 2022, 1216: 339991. doi: 10.1016/j.aca.2022.339991 [47] 孙刚, 袁守军, 彭书传, 等. 固相萃取-高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素[J]. 环境化学, 2010, 29(4): 739-743. SUN G, YUAN S J, PENG S C, et al. Determination of oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline in manure by spe-hplc method[J]. Environmental Chemistry, 2010, 29(4): 739-743 (in Chinese).
[48] GONG X, LI X, QING T P, et al. Amplified colorimetric detection of tetracycline based on an enzyme-linked aptamer assay with multivalent HRP-mimicking DNAzyme[J]. Analyst, 2019, 144(6): 1948-1954. doi: 10.1039/C8AN02284D [49] ZHU B C, DONG S M, LIU Z C, et al. Enhanced peroxidase-like activity of bimetal (Fe/Co) MIL-101 for determination of tetracycline and hydrogen peroxide[J]. New Journal of Chemistry, 2022, 46(45): 21834-21844. doi: 10.1039/D2NJ04403J -
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