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汞（Hg）是一种天然存在的有毒持久性污染物，是环境中毒性最强的重金属元素之一[1]。甲基汞（MeHg）是一种毒性极强的有机汞化合物[2]，可通过食物链生物放大效应在高营养级生物体中高度富集[3]。MeHg进入人体会对人的中枢神经系统产生极大危害，导致中枢神经系统发育障碍，还可引起神经衰弱、精神障碍等神经精神症状[4]。人类暴露MeHg的主要途径之一是食用水产品[5]。由于MeHg在鱼类等水产品中富集造成了严重的人体暴露风险，汞已经被各国列为优先控制污染物，汞污染已经成为全球最重要环境问题之一[6]。
自20世纪80年代以来，渔业资源的匮乏使得全球水产养殖业迅速发展。高密度网箱养殖模式向水中投放的大量饵料只有25%—35%被鱼类摄食，其余部分残留在水体中[7]。饵料中富含氮、磷等营养盐随水溶出进入水体[8]，是造成水体富营养化加重，进而导致藻华发生的重要原因之一。在水生生态系统，藻类死亡后大量残体沉积进入水底，导致沉积物中有机质大量积累，进一步诱导水质恶化，污染物形态也随之发生改变[9]，对水生生态系统环境质量造成显著影响。
溶解性有机物（dissolved organic matter, DOM）是多种化学成分组成、结构复杂且具有较宽分子量分布的有机化合物复杂混合体[10]，其中包括蛋白质、氨基酸、糖类、木质素、脂类和腐殖酸等化合物[11]，主要来源于生物分泌物和动植物残体碎屑[12]。DOM广泛分布于河流、湖泊、海洋等水环境中，是水生生态系统中最活跃的有机质组分。由于其含有大量官能团，可以与水体中重金属络合形成配合物[13]，从而影响水体中痕量金属离子物理迁移、化学转化以及生物可利用性等[14]。
由于DOM组成复杂，目前关于DOM对无机汞（IHg）甲基化影响观点并不统一。已有研究表明，DOM对汞甲基化的影响具有双重效应，一方面能促进汞甲基化过程—这是因为DOM能够作为碳/氮来源，为微生物对汞甲基化过程提供丰富的营养物质，增强微生物活性，从而促进IHg向MeHg转化[15]。Gascon等[16-17]研究结果证实了水库、湖泊和海洋水体中MeHg浓度与水体内源DOM浓度相关。在Fellman等[18]研究发现，欧洲溪流中MeHg浓度与内源DOM的含量呈正相关，这说明内源DOM对于水体中MeHg的形成具有非常重要的影响。另一方面，有研究认为DOM对汞甲基化起到抑制作用。DOM是天然水体中最重要的汞络合剂之一。一些研究认为DOM抑制汞甲基化主要是因为与汞离子发生吸附、络合等作用，影响了汞在介质中的迁移转化，降低了其生物有效性，从而影响了MeHg的产生[19]。
藻类残体作为水体中主要的内源有机物，藻华大面积爆发必然引起水体有机质含量和组成性质的变化。大量研究表明，水生态系统中MeHg浓度变化与藻类产生量有密切关系，藻源有机物的存在能够加快水体中IHg向MeHg的转化[1, 20-22]。由于渔业养殖区水体氮、磷等营养盐含量较高，易造成水体富营养化加重和藻华爆发，藻类中DOM进一步影响养殖区水体汞形态变化，进而对人类健康产生危害而目前关于渔业养殖区藻源DOM对汞甲基化研究还鲜有报道。
本研究以渔业养殖区藻类DOM为研究目标，研究藻源DOM在汞甲基化过程中影响，同时结合傅里叶红外光谱与三维荧光光谱技术，剖析藻源DOM组成及结构特征，从微观角度探究藻源DOM影响汞甲基化的作用机制，以期为控制养殖水体中汞甲基化的形成提供理论依据。
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本研究所用藻类样品采集于浙江省宁波市渔业网箱养殖区（29°25.71′N，121°31.93′E）。在秋季收集养殖区内新鲜藻类，将采好的新鲜藻类保存在4 ℃恒温箱内带回实验室。除去已腐烂的藻及其他杂物后，用水清洗掉藻中掺杂的泥沙，并用去离子水淋洗数次。将洗净的藻类置于冷冻干燥机中冷冻干燥，粉碎机粉碎后保存备用。
DOM样本的提取及制备，采用超纯水浸提法[23]：取粉碎过筛后筛粉3 g，与超纯水按1:10的比例进行混合，放置在25 ℃的恒温振荡箱中避光振荡24 h后高速离心，转速12000 r·min−1，时间20 min。取上清液过0.45 µm醋酸纤维素滤膜，获得过滤产物即为DOM样品，置于4 ℃冰箱内保存备用。
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将提取好的DOM样品冷冻干燥，获得的结晶样品与KBr按1∶100质量比混合压片制样后，用傅里叶变换红外光谱仪（IR Prestige-21）测定DOM的红外光谱，扫描波数范围为500—4000 cm−1，波数精度0.01 cm−1，每个光谱经32次扫描搜集而得到，并通过H2O、CO2以及环境空气矫正光谱。每个光谱分析前测定光谱背景值以降低干扰。
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紫外吸收光谱和三维荧光光谱（3D-EEM）采用Horiba公司Aqualog®荧光光谱仪进行测定。具体测定方法及光谱参数参照高洁等[24]的实验方法：紫外-可见吸收光谱以Milli-Q水为空白，用10 mm石英比色皿在230—800 nm范围内扫描，间隔1 nm，以355 nm处吸收系数a（355）表示有色DOM相对浓度；荧光光谱以Milli-Q水为空白，激发波长（Ex）范围230—450 nm，增量5 nm，发射波长（Em）范围250—620 nm，扫描信号积分时间3 s，光源为150 W无臭氧氙弧灯，系统自动校正瑞利和拉曼散射。DOM浓度以总有机碳（TOC）表示，采用总有机碳分析仪（multi N/C 2100）测定。
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一般来说，养殖水体TOC浓度在5.11—19.42 mg·L−1[25]，但在富营养化水体中，溶解性有机质含量可以高达37.28 mg·L−1[26]，且为使实验结果更明显，将提取好的DOM用超纯水分别调至TOCDOM=10 mg·L−1、TOCDOM=50 mg·L−1备用。水体中汞本底浓度在0.03—2.00 µg·L−1[27]，考虑外源污染的输入以及测汞仪的检测精度，本实验用HgCl2溶液汞浓度按照实验梯度分别设为100、200、400、800、1600、3200 ng·L−1。DOM溶液与汞溶液按1:2的体积比混合均匀，室温条件下培养2 d[28]，使其充分反应，采用蒋红梅等[29]建立的蒸馏—乙基化结合气相色谱（GC）—冷原子荧光（CVAFS）法测定其MeHg含量，方法回收率为88.2%—108.4%，方法空白为（0.045±0.003）ng·L−1，检出限为0.009 ng·L−1。取培养好的样品于二连通Teflon蒸馏瓶中，125 ℃加热蒸馏瓶，使气相中的MeHg随氮气进入有冰水浴冷却的接收瓶中；将蒸馏液转移到气泡瓶中定容至80 mL，加入NaBEt4试剂密闭条件下反应17 min后氮吹，使MeHg富集在Tenax管上。将Tenax管接入测汞仪（BROOKS RAND Model Ⅲ，美国）测定样品中MeHg含量。实验共计12个处理，以超纯水与汞溶液混合做对照，每个处理设4个重复。实验用超纯水pH为6.45，水温为21℃。
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数据处理采用Microsoft Excel 2016，由SPSS 25进行数据统计分析，P<0.05表示各组处理之间存在显著差异，图表制作采用Origin 2018。MeHg实验测量按10%的平行操作，做标准曲线并测定空白及标样，对数据进行质量控制。分析重复样品的相对标准误差< 4.5%。
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渔业养殖区海藻DOM的红外光谱特征如图1 所示。藻源DOM在3415 cm−1处有一个明显的吸收峰，为O—H的伸缩振动产生[30]，表明藻源DOM中含有较多的羟基。峰值出现在2850—3000 cm−1处的吸收峰，为脂肪族C—H的伸缩振动（包括—CH3、—CH2—的反对称伸缩），说明该DOM中可存在脂肪族甲基或亚甲基[31]。出现在1645 cm−1和1408 cm−1处的吸收峰分别对应C=C、C=O和COO—的伸缩振动，824 cm−1对应羧酸中OH的伸缩振动，说明海藻DOM中羧酸基团较为丰富。海藻DOM在表征芳香结构的1250 cm−1处出现了较为明显的吸收峰，表明尽管作为内源有机碳的代表，藻源DOM中仍含有一定量的芳香性组分。而在1055 cm−1附近出现了多个峰，意味着存在多糖类物质C—O拉伸带，这表明海藻DOM中可能含有较多的碳水化合物或水溶性多糖类物质[32]。此外，在610 cm−1处的吸收峰表明DOM中可能含有酰胺类物质[33]。
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已有研究指出，三维荧光光谱法对DOM的表征快速且灵敏[34]，可以检测到DOM中不同类型的荧光峰[35]，是对DOM特性进行“指纹识别”的有效工具，已经被广泛应用于不同环境系统中DOM的表征[36]。本研究中，共观察到两类5个荧光峰（图2），分别属于类腐殖质和类蛋白质两大类：荧光峰A （Ex/Em=260 nm/380 nm） 为紫外光区类腐殖质荧光峰；荧光峰B （Ex/Em=275 nm/320 nm） 为类酪氨酸荧光峰；荧光峰C （Ex/Em=335 nm/420 nm） 为可见光区类腐殖质荧光峰；荧光峰M （Ex/Em=320 nm/406 nm） 为微生物源类腐殖质荧光峰；荧光峰T （Ex/Em=275 nm/330 nm） 为类色氨酸荧光峰[37]。各荧光峰强度见表1。从藻源DOM三维荧光光谱图中观察到的多个荧光峰说明了藻源DOM组成的复杂。且由图2可以看出，藻类DOM中类蛋白质荧光峰表现出了较高的吸收强度，说明藻源DOM中蛋白质类组分所占比例较大。对比其他类型DOM可以发现（表1），该藻源DOM在有机组成上与其他类型DOM存在较大差异，其有机组分整体低于鱼粮和鱼粪便来源DOM，这可能是由于鱼饲料中人为添加的有机质较多。
表2列出了本研究所用海藻DOM紫外吸收光谱特征参数，并与其他来源DOM进行比较。SUVA254常用来表征DOM的芳香性大小，其值越大，DOM的芳香化程度越高。SUVA260通常用来表征DOM疏水性的高低，与疏水性组分呈正相关关系；SUVA260与SUVA254的变化趋势一致，即DOM芳香性越高，其疏水性也越强[39]。Her等[40]的研究结果表明，藻源DOM中含有较多的蛋白和多糖类有机物质。对样本的紫外吸收结果进行分析，发现该种藻源DOM的SUVA值较低（SUVA<0.7），说明藻源DOM中对紫外吸收较低的多糖类和蛋白质类有机物质所占比例较大，而对紫外吸收较高的腐殖酸类物质所占比例较小[41]，这与三维荧光光谱检测结果一致，也与Her等研究结果相符。光谱斜率S275-295和SR均可反映DOM分子量大小，其值越小，DOM分子量越大[39]。藻源DOM较低的光谱斜率表明其中含有较多大分子量物质，进一步说明藻源DOM中大分子多糖和蛋白质类有机物质的存在。相比于鱼粮、狗牙根和猪粪便中DOM，该种藻源DOM芳香化程度较低，DOM中所含疏水性组分较少，但其芳香性和疏水性略高于鱼粪便和底泥来源DOM。
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已有研究表明，DOM对汞甲基化的影响具有双面性，He等[15]认为有机质可以提供汞甲基化过程需要的电子供体，从而促进汞向MeHg转变，同时，由于DOM中疏水性有机组分与Hg2+结合能力较弱，对Hg2+活性影响较小，有利于汞甲基化发生[42]；而Chirenje等[43]认为，由于DOM中含有大量羟基、羧基、甲基等官能团，可以与重金属汞产生络合作用，降低汞在水体中的迁移转化，从而限制汞甲基化过程，另一方面，DOM中亲水性物质与Hg2+有较强的络合能力，可以降低水体中参与汞甲基化的离子浓度，也可以减弱汞甲基化过程[44]。此外，还有一些研究表明，水体中MeHg含量会随着有机物含量的升高而增加[45]；然而也有学者认为，高浓度DOM在某种程度上也可以抑制甲基化的进行。
图3显示了在不同汞浓度水平下，DOM浓度对MeHg产生的影响。由图3可以看出，不同汞浓度下DOM对汞甲基化的影响并不相同。随着汞浓度增加，对照组MeHg产生量逐渐增加，这可能是由于实验环境条件带有部分微生物，在没有DOM存在的条件下，溶液中的微生物也会与Hg2+反应生成MeHg。在本实验较低浓度汞溶液中（THg≤200 ng·L−1），添加DOM的处理组MeHg产生量高于对照组，即两种浓度DOM均促进了MeHg的产生，且促进作用达到显著水平（P<0.05），这可能是由于DOM中含C官能团可以作为汞甲基化过程的甲基供体，参与汞甲基化反应，进而对汞甲基化过程产生促进作用。随着汞浓度逐渐升高（200 ng·L−1<THg≤800 ng·L−1），低浓度DOM（DOM10）所提供的甲基供体可能不足以满足汞甲基化过程需求，因而其对MeHg的产生促进效果不显著，基本与对照组持平，而高浓度DOM（DOM50）由于浓度较高，其中含C官能团相对较多，可以提供足够多的甲基供体，从而仍能表现出明显的促进作用，且MeHg产生量显著高于对照组，此时两种浓度DOM对汞甲基化的影响产生了显著差异（P<0.05）；而在更高汞浓度条件下（THg≥1600 ng·L−1），在添加DOM的处理组中，MeHg产生量明显低于对照组，两种浓度DOM均表现出抑制MeHg生成，且抑制作用达到极显著水平（P<0.01）。此时DOM对汞甲基化的影响呈现出与中低汞浓度条件下相反的趋势。这可能是由于汞浓度较高时，DOM50中的甲基供体也无法满足汞甲基化需求，且DOM中中疏水性组分较少，大量亲水性物质也可与Hg2+发生络合，使得溶液中游离的自由离子浓度降低，参与甲基化的Hg2+活性降低，DOM表现出抑制汞甲基化的作用；此外，导致溶液中MeHg含量降低的另一个原因可能是由于溶液中汞浓度过高，较高的汞对微生物产生毒害作用，导致微生物活性降低。
图4为不同浓度DOM在汞浓度不同时对甲基汞转化率（%MeHg）的影响。结果表明，随着溶液中汞浓度升高，无论是对照组还是添加DOM的处理组，甲基汞转化率均呈现整体降低的趋势，对照组%MeHg由0.113%降至0.025%，添加DOM的处理组%MeHg分别从0.18%和0.257%降至0.009%和0.008%。在THg≤200 ng·L−1时，与对照组相比，添加DOM均可以提高MeHg的转化率，推动IHg向MeHg的转变，且DOM50的促进作用比DOM10更明显，在两个汞浓度下分别高出了0.077%和0.016%。在中高汞浓度的条件下（200 ng·L−1<THg≤800 ng·L−1），DOM10对于IHg向MeHg转化基本没有影响，而 DOM50仍表现出较显著的促进作用，%MeHg可以达到0.093%和0.065%。THg浓度进一步升高，DOM不仅没有表现出促进汞甲基化的能力，反而降低了甲基汞转化率，其%MeHg均低于未添加DOM的对照组，抑制了汞向MeHg转化，此时不同浓度DOM对汞甲基化的影响差异不明显。
综合分析两种浓度DOM对汞甲基化影响结果，可以得出其与DOM和THg质量比之间的大致联系。如图5所示，随着溶液中DOM含量逐渐增大，溶液中MeHg转化率整体呈现增大趋势。与对照组相比，在DOM∶Hg≤15625时，添加了DOM的处理组%MeHg与对照组无明显差异（P>0.05），而随着溶液中DOM含量升高，在DOM∶Hg>15625时，DOM显著促进了溶液中MeHg的转化，其%MeHg比空白组高出0.60—1.79倍，这与龚贵清等[38]研究结果一致。Markus等[46]对汞与DOM的结合机理进行研究，发现在DOM∶Hg=500时，溶液中汞几乎全部作用于DOM上的强结合位点，随着比例增大，DOM上的强结合位点已经过量，DOM与Hg不再发生络合作用。本实验所选用DOM∶Hg浓度比均大于500，因此无论DOM含量多少，其上络合位点均已达到饱和，低浓度DOM中甲基供体数量有限，不足以满足汞甲基化过程；随着DOM含量逐渐增大，其中大量含C官能团作为甲基供体，参与溶液中汞甲基化反应，推动了汞向MeHg的转化。何小松等[47]研究了垃圾渗滤液中水溶性有机质与汞相互作用，发现DOM中容易被生物利用的类蛋白组分是Hg2+的强有机配位体。因此在实验DOM浓度较高时，其中的类蛋白组分也能够与Hg2+结合，提高Hg2+生物可利用性，继而促进溶液中汞的甲基化，且DOM中脂肪链烃结构也可以作为碳氮来源提高微生物活性，促进MeHg产生。
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（1）渔业养殖区藻源DOM主要由类腐殖质和类蛋白质两大类物质组成，其中类蛋白质所占比重较大；藻源DOM含有羟基、甲基、亚甲基、芳香性C=C等官能团，可能含有羧酸类、脂肪烃类、芳香族化合物和酰胺类等物质；DOM芳香化程度较低，所含疏水性物质较少，大分子多糖和蛋白类物质含量较高。
（2）不同汞浓度下，DOM对汞甲基化影响不同。在汞浓度较低时，DOM上含C官能团作为甲基供体可显著促进汞甲基化过程；随着汞浓度升高，不同浓度DOM提供的甲基供体量不同，因而低浓度DOM没有明显促进作用，而高浓度DOM仍能促进汞甲基化；汞浓度更高时，DOM中大量亲水性物质与IHg络合，降低了溶液中IHg活性，从而抑制汞甲基化。
（3）不同浓度DOM对汞甲基化过程的影响不完全相同。在高汞浓度范围内，DOM的络合作用表现出降低汞甲基化的趋势，而在低汞浓度范围内，DOM上的类蛋白组分提高了汞的生物利用性，且DOM作为甲基供体和碳氮来源显著促进了汞的甲基化。考虑外源污染输入和仪器检测精度的影响，本实验选用了较高浓度的汞溶液和DOM提取液，而从实验完整性出发，后续应设置低汞浓度和较小DOM浓度梯度进行研究。
图 1
藻源DOM红外光谱图
Figure 1.
IR spectra of DOM from algae
