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在石油的开采、冶炼和加工中，不可避免地存在由于石油泄漏而带来的土壤污染问题. 石油烃外碳源向土壤的大量输入，引起土壤氮源相对不足是导致土壤微生物活性降低、抑制土著微生物降解石油烃的主要因素. 因此，向污染土壤中加入外氮源进行生物刺激修复可对石油烃降解起到促进作用. 许多研究对利用生物刺激剂修复石油污染土壤进行了详细报道. 所用氮源类型包括无机氮源NH4Cl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4，有机氮源尿素和有机肥等[1 − 3]. 研究认为，当土壤C/N比接近10时，土壤微生物的活性最好，对石油烃的去除能力最强[4].
土壤菌群结构多样性和功能菌群活性对于生物技术的实施至关重要. 目前多是利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）、实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）、高通量测序（high throughput sequencing）、宏基因组学（metagenomics）等技术对土壤菌群结构和功能代谢基因表达进行研究[5 − 7]. 修复过程中可降解石油烃的功能菌属主要有细菌芽孢杆菌属（Bacillus）、铜绿假单胞菌属（Pseudomonas）、不动细菌属（Acinetobacter）、红球菌属（Rhodococcus）、原小单孢菌属（Promicromonospora），以及真菌的担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）等[8 − 10]. 生物刺激修复可较好地保持土壤微生物菌群结构多样性和稳定性，有利于石油烃的持续降解[11 − 12]. 现有研究阐明了石油烃降解功能菌属类别以及土壤菌群稳定性对生物修复的影响作用，但是对于不同功能类群参与石油烃降解的作用强度和利用特征尚不清楚.
磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acids, PLFA）是几乎所有活体细胞膜的主要成分，周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解. 不同类群的微生物PLFA组成具有一定差异，因而磷脂脂肪酸可作为生物标识物用以描述微生物类群对不同碳源的利用特征 [13 − 14]. 目前PLFA技术主要用于研究农业上施肥、植物残体及植被种植等因素对土壤微生物群落活性的影响[15 − 17]，较少用于研究污染土壤生物修复过程中功能微生物类群对石油烃组分的利用特征.
烷烃是石油烃的重要组分之一，本文以13C-十六烷标记的污染土壤为研究对象，通过向污染土壤中加入硝酸钾和有机肥进行生物刺激修复处理，利用稳定同位素标记-磷脂脂肪酸技术（13C -SIP-PLFA）探究十六烷中碳组分被不同土壤微生物类群的利用情况，本研究可为深入理解石油烃的生物降解代谢过程提供参考.
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实验所用土壤为取自陕西省延安市安塞县未受石油污染的黄绵土. 土壤基本理化性质采用常规方法进行分析[18]（表1）. 土壤经剔除可见杂质、自然风干、研磨粉碎后将其铺平摊薄，去除土壤中残留的细微植物残体和根须，随后过100目筛并充分混匀后，装于自封袋中，−80 ℃下储存备用.
所用腐熟有机肥取自西北农林科技大学，是以干质量比1:2的猪粪:稻壳加入5.0%的木炭渣经堆制腐解而成. 有机肥中的主要元素含量为C、N、P、K、Na、Ca、Mg、Al、S、Cu、Fe、Mn、Mo、Zn分别为185600、20400、6500、36200、3810、2130、2420、1330、1575、400、1615、284、4.46、140 mg·kg−1.
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13C-十六烷配制：0.2500 g丰度99% atom的标记十六烷（十六烷-1,2-13C2, Sigma公司）与4.7500 g丰度1.108% atom的分析纯十六烷（Sigma 公司）充分混合，计算其13C丰度为5.976% atom.
实验方案设计如表2所示. 取9份100 g晾干磨碎并过100目筛的土壤分3组（每组3个平行），分别加入5000 mg·kg−1 13C-十六烷标记物、5000 mg·kg-1 13C-十六烷标记物和硝酸钾（调节土壤碳氮比为10/1）、5000 mg·kg-1 13C-十六烷标记物和有机肥（添加量150 g·kg−1），将各组土壤充分混合均匀.3组处理编号分别为：CC、CN和CY.室温条件下在0、3、30 d采集各组土壤样品，于−80 ℃下保存待测.
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土壤中正十六烷利用超声萃取提取-GC/MS测定. 超声提取和GC/MS测定方法详见文献[19].
土壤PLFA的提取 微生物群落结构用土壤磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）表示. 土壤PLFA的提取方法见文献[19]. 基本步骤为：利用氯仿:甲醇:柠檬酸=1:2:0.8作为提取剂提取土壤中的磷脂、糖脂和中性脂，以氯仿和丙酮作为洗脱剂，利用SPE柱（Supelco公司）分离去除糖脂和中性脂，向提取获得的磷脂中加入甲醇:甲苯（1:1）的混合液和0.2 mol·L−1 KOH甲醇溶液进行甲酯化后，加入蒸馏水和冰醋酸，再用正己烷萃取获得磷脂脂肪酸甲酯，用氮气吹干后，在酯化的样品中加入19:0甲基酯作内标，将磷脂脂肪酸甲酯溶解于60 μL正己烷中.
土壤PLFA碳同位素的测定 用气相色谱仪（Trace GC 1310 +GC IsoLink Ⅱ连ConFlo Ⅳ（测可气化有机物中的CNHO））进行检测，利用MIDI SHERLOCCS微生物鉴定系统进行脂肪酸的比对鉴定. 脂肪酸的定量采用峰面积和内标曲线法. 单个PLFA的13C/12C用气相色谱-燃烧法-稳定同位素比质谱仪（GC-C-IRMS）进行测定，测定方法详见文献[19].
共检测出含有13C-同位素的18种PLFA单体，以18:1ω9c指示真菌；以16:0（10Me）、17:0（10Me）、18:0（10Me）、17:1ω7c（10Me）指示放线菌；以i15:0、i16:0、i17:0、a15:0、a17:0指示革兰氏阳性菌（G+）；以16:1ω5c、16:1ω7c、18:1ω5c、18:1ω7c、cy17:0ω7c、cy19:0ω7c指示革兰氏阴性菌（G−）；以16:0、18:0指示Unspecific菌[20]. 将所有微生物PLFAs总和表征为总微生物量.
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土壤中各磷脂脂肪酸单体含量为：
式中，PF为土壤中磷脂脂肪酸单体的含量，nmol·g−1；AF和ASTD为样品和内标物（甲基酯19:00）的峰面积；WSTD为内标物（甲基酯19:00）的质量，μg；W为干土重量，g；M为各磷脂脂肪酸单体的相对分子质量，g·mol−1.
稳定同位素比率计算：
式中，Rsample为样品13C/12C原子比值；Rstandard为标准品（美国卡罗莱纳州白垩纪皮狄组层位中的拟箭石化石, PDB）原子比值，数值为0.011802.
PLFA单体中13C的量：
式中，13C-PF为PLFA单体中的13C的量，ng·g−1；（%atom13C）LP和（%atom13C）ULP分别为标记样品PLFA和未标记样品PLFA单体中的%atom13C，LPC为标记样品PLFA单体中碳含量，ng·g−1.
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采用Excel2010和SPSS 25.0进行数据正态性和方差齐性检验，同一时期不同处理、同一处理不同时期差异显著性用One-way ANOVA（单因素方差分析）检验，利用LSD, P<0.05（最小显著差数法）进行多重比较，采用Origin 2021绘制图表，数据表示为平均值±标准差.
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向十六烷污染土壤中分别加入KNO3、有机肥进行生物刺激修复，比较了自然降解（CC）、KNO3生物刺激修复（CN）、有机肥生物刺激修复（CY）对十六烷的去除效果（图1）.
修复初期（修复3 d），十六烷在自然降解和加入KNO3修复处理的土壤中降解较为迅速，烷烃含量由5000 mg·kg−1降低至4793 mg·kg−1和4800 mg·kg−1，加入有机肥修复处理的土壤中烷烃含量为4891 mg·kg−1. 修复30 d时，加入两种修复剂处理的土壤中烷烃去除效率显著提高，十六烷含量降低至4323 mg·kg−1（CN）和4250 mg·kg−1（CY）（图1a）. 与未经修复处理的土壤相比，烷烃降解率分别提高为自然条件下的2.21倍和2.44倍，说明加入外源氮进行生物刺激修复可有效提高土壤微生物对烷烃的降解效率（图1b）.
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修复期间，自然降解（CC）的土壤中PLFA总量变化不明显，为80.82—82.83 nmol·g−1. 各微生物类群PLFA含量由高到低依次为：G－（30.30 nmol·g−1）> G＋（16.96 nmol·g−1）>放线菌（14.76 nmol·g−1）>Unspecific 菌（11.44 nmol·g−1）>真菌（7.36 nmol·g−1）. 土壤中含量较多的9种PLFA单体（大于3 nmol·g−1）包括 Unspecific菌16:00，G＋菌i15:0、a15:0，G－菌16:1ω5c、16:1ω7c、18:1ω7c、cy19:0ω7c，真菌18:1ω9c和放线菌16:0（10Me）（图2, 图3），其PLFA单体的含量分别为9.42、6.55、3.96、4.91、6.45、11.05、4.11、7.36、9.70 nmol·g−1.
向污染土壤中加入KNO3修复处理3 d，PLFA总量略有降低；修复30 d 时，PLFA总量为79.70 nmol·g−1. 5种微生物类群G－、 G＋、放线菌、Unspecific菌、真菌的PLFA含量分别为30.36、15.98、14.60、11.20、7.56 nmol·g−1，各微生物类群和9种PLFA单体在修复期间含量变化不大. 加入有机肥修复处理初期（修复3 d）的各微生物类群PLFA含量和总PLFA含量增加，修复至30 d时显著降低，土壤中总PLFA为99.33 nmol·g−1，5种微生物类群PLFA含量为36.26、21.97、14.41、9.57、17.12 nmol·g−1.
十六烷污染和修复处理的土壤样品中不同微生物类群特征脂肪酸含量由高到低依次为：G－细菌>G+细菌>放线菌>Unspecific菌>真菌. 与未经修复处理的土壤（CC）相比，加入KNO3修复处理（CN）对土壤中的总PLFA和各生物类群PLFA影响较小，有机肥施入（CY）显著增加了土壤中总PLFA含量，其中Unspecific菌、G＋、G－菌PLFA的增量最大（图2）.
总体而言，加入修复剂处理的G+/G−的PLFA比值随时间变化不显著，但对细菌/真菌的PLFA比值影响较显著（表3）. 加入有机肥进行修复对 G + /G-的 PLFA 比值有显著影响，对细菌/真菌的的 PLFA 比值影响不显著. 加入有机肥进行修复 G + /G－比值高于自然降解和加入硝酸钾进行修复处理的土壤.加入有机肥进行修复对G +/G-的PLFA比值有显著影响，对细菌/真菌的的PLFA比值影响不显著. 加入有机肥进行修复G+ /G－比值高于自然降解和加入硝酸钾进行修复处理的土壤.
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通过测定不同修复处理土壤微生物PLFA单体中13C含量可以了解各微生物类群对十六烷的利用情况. 根据图4可知，在不同修复处理的土壤中，可利用十六烷的微生物主要有G+菌i15:0、a15:0，G-菌16:1ω5c、16:1ω7c，真菌18:1ω9c、放线菌16:0（10Me）和Unspecific菌16:00.土壤中烷烃的降解代谢需要5种不同微生物类群的协同作用. 在3种修复处理进行至3 d时，各微生物类群PLFA中13C含量较低. 修复至30 d时，3种修复处理的土壤微生物类群中的13C含量显著增加，说明修复30 d时土壤微生物已适应了十六烷的污染，并以十六烷作为碳源底物进行同化代谢.
自然降解30 d的土壤（CC）中，i15:0、a15:0、16:1ω5c、16:1ω7c 、18:1ω9c、16:0（10Me）和16:007种PLFA单体中的13C总量为81.12 ng·g−1，其中G+（i15:0、a15:0）和真菌（18:1ω9c）中13C含量最高，分别为27.41 ng·g−1和18.61 ng·g−1，占7种PLFA单体中13C总量的33.8%和22.9%.
加入硝酸钾作为生物刺激剂修复30 d 时， 上述7种PLFA单体中13C总量增加至92.84 ng·g−1，5种可同化代谢十六烷的微生物类群中，G+菌（i15:0+a15:0）和真菌（18:1ω9c）PLFA中13C含量分别增加了6.72 ng·g−1和5.94 ng·g−1，Unspecific菌、G-菌、放线菌PLFA中13C含量变化不大.
加入有机肥进行修复处理30 d， 7种PLFA单体中13C总量增加至142.67 ng·g−1，5种微生物类群PLFA中13C含量均增加，其中G+菌（i15:0+a15:0）、Unspecific菌（16:00）、放线菌（6:0（10Me））PLFA中的13C含量增加最明显，增量分别为31.77、10.19、9.11 ng·g−1. 说明向十六烷污染土壤中加入硝酸钾或者有机肥进行修复处理，可以提高土壤微生物类群对十六烷的同化利用，但是两种修复剂对土壤中不同微生物类群代谢十六烷的激活作用上存在差异，加入有机肥修复处理对微生物同化代谢污染物的激活作用更为显著.
图5为不同生物类群PLFA单体中的13C含量，图6为不同处理土壤中各类群PLFA利用13C的相对丰度. 根据图5和图6，在加入硝酸钾修复的土壤中，各微生物类群PLFA中13C含量由高到低顺序为：G+菌>真菌> Unspecific 菌> G-菌>放线菌；加入有机肥修复的土壤中各微生物类群的13C含量由高到低的顺序为：G+菌>Unspecific菌>真菌> G-菌>放线菌. 总体上，两种修复处理的土壤中革兰氏阳性菌对十六烷的利用率最高，放线菌对十六烷的利用率最低. 加入有机肥修复处理可显著促进G+菌和Unspecific菌对十六烷的同化代谢.
不同类群微生物的磷脂脂肪酸（PLFA）组成具有一定差异，因此PLFA可用于表征土壤中各微生物类群的活性.PLFA单体中的碳主要来源于土壤有机质以及添加的外源碳（该文中为13C-十六烷中的碳），因此可利用13C -SIP-PLFA技术研究可利用十六烷进行同化代谢作用的微生物群落变化情况. 土壤中外碳源的大量引入导致了土壤中氮素的相对不足. 在对石油烃污染土壤进行修复时，根据石油烃中碳素含量（一般按石油烃含量的85%计），加入硝酸钾等外源氮调节土壤C/N比（一般为10/1）是常用的污染土壤修复方式. 有研究认为外源氮的加入可提高土壤中石油烃降解功能菌的活性[21]，也有研究认为在加入硝态氮修复柴油污染土壤时，从亚硝酸盐到铵的转化受到低丰度亚硝酸盐还原酶的限制，进而降低了了石油烃的降解速率[22]. 本文利用硝酸钾作为生物刺激剂对污染土壤修复30 d，可有效提高土壤中十六烷的去除效率.PLFA分析结果表明，加入硝酸钾进行生物刺激修复使得土壤中活性微生物数量略有降低（土壤PLFA总量由82.8 nmol·g−1降低至79.7 nmol·g−1），但是PLFA中的13C含量、尤其是G+菌和真菌PLFA中13C含量明显增加，说明在加入硝酸钾修复的土壤中,尽管烷烃降解功能类群对十六烷同化代谢作用的增强与烷烃降解效率存在一定的相关关系，但土壤中总微生物活性并不能指示功能类群对十六烷的同化代谢作用.
有机肥中含有丰富的微生物和养分. 农业上向种植作物的土壤中施入有机肥能改善作物根际微生物菌群，提高植物的抗病虫能力[23]. 在环境领域，用有机肥作为生物刺激剂修复污染土壤，可促进石油烃污染物的降解[24 − 25]. 本文中，有机肥的施入显著提高了土壤微生物的总PLFA含量，并且各微生物类群PLFA中的13C含量也明显增加，说明有机肥的施入同时提高了土壤总微生物和烷烃代谢功能类群的活性. 这与施入硝酸钾修复对土壤总微生物活性的影响作用存在差异. 多数农田中革兰氏阳性菌数量多于阴性菌[16]. 本文中3种修复处理土壤中G+/G−的PLFA比值约为0.55—0.60，可能是由于重度烃污染改变了土壤中G+/G−微生物的类群分布，使得土壤中革兰氏阴性菌数量多于阳性菌. 一些文献报道了在石油烃污染的土壤中，大量的革兰氏阴性菌（主要是变形菌）得以富集[26 − 27]，论文的研究结果和文献报道一致. Atlas和Bartha[28]利用r-K繁殖策略对土壤受到石油烃污染后革兰氏阴性菌的富集进行解释，认为革兰氏阴性菌多是r-繁殖策略者，增殖速率快且种群增长率大，因此能够在重度污染的土壤环境中短时间内快速繁殖.
尽管在重度烃污染的土壤中富集生长了大量的革兰氏阴性菌，然而，污染土壤中革兰氏阳性菌的13C-PLFA含量却高于革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌是对十六烷同化代谢能力最强的微生物类群. 加入两种不同生物刺激剂进行修复处理时，G+菌PLFA中的13C增量最多，说明生物刺激修复对G+菌同化代谢十六烷的激活效应最强. 可能是由于G+菌具有较厚而致密的肽聚糖层（20—80 nm），对于外部环境变化具有更强的适应特性，使得许多革兰氏阳性菌在污染环境条件下产生的芽孢对于生物刺激剂具有更好的应激效应[29 − 30]. 另一方面，加入硝酸钾进行修复处理使得G+菌和真菌PLFA中13C含量增加显著（增量为6.72 ng·g−1和5.94 ng·g−1），而加入有机肥修复处理显著增加了G+菌、Unspecific 菌、放线菌PLFA中的13C含量（增量分别为31.77、10.19、9.11 ng·g−1），两种修复处理对烷烃代谢功能类群的激活效应存在差异，进一步说明两种修复剂对土壤中十六烷烃同化代谢菌的激活机制上存在差异.
根据文献报道，有机肥对土壤中有机污染物的去除作用，一方面是由于堆肥的保水、保温能力及堆肥中丰富的营养可提高土著微生物的活性. 另一方面，堆肥中的腐殖质可以降低土壤有机质对有机污染物的吸附锁定作用. 此外，有机肥中蕴含的微生物与土壤中土著微生物存在一定的作用关系（种间共处或者互生），进而促进了十六烷的降解[31].
课题组的前期研究表明，加入有机肥对石油污染土壤进行修复处理，土壤微生物多样性增加，土著优势菌属的生长则受到抑制，非优势菌的生长得以促进，同时出现了一些新的降解菌属[31]. 本文中，加入有机肥修复的土壤中微生物PLFA含量和13C-PLFA含量显著增加，说明有机肥的加入促进了土壤微生物活性和对烷烃的代谢，有机肥中的微生物和土壤土著微生物之间可能存在协同作用关系.
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十六烷污染的土壤中，各微生物类群PLFA含量由高到低依次为：G－菌>G+菌> 放线菌>Unspecific 菌>真菌. 向十六烷重度污染的土壤中加入硝酸钾和有机肥均能促进十六烷的降解. 加入KNO3修复处理降低了总PLFA含量，但是使得G+菌和真菌PLFA中13C含量增加显著. 施入有机肥可显著增加土壤中总PLFA含量，同时使得G+菌和放线菌PLFA中的13C含量增加显著. 土壤总微生物活性并不能指示烷烃的生物降解效率，烷烃降解功能类群对烷烃同化代谢作用的增强与石油烃的降解效率存在一定的相关关系. 不同生物刺激剂对土壤中的十六烷烃同化代谢菌的激活机制上存在差异.
硝酸钾和有机肥添加对土壤中十六烷的降解效果及微生物类群活性变化研究
Effects of potassium nitrate and organic fertilizer on microbial activity in hexadecane-contaminated soil
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摘要: 向污染土壤中加入外源氮进行生物刺激修复是目前广为采用的土壤有机污染修复技术. 然而，目前对于修复过程中土壤微生物类群对组分烃的代谢特征尚不清楚. 本文以13C标记的十六烷污染土壤为研究对象，利用稳定同位素标记-磷脂脂肪酸技术（stable isotope labeling-phospholipid fatty acid technology，13C -SIP-PLFA）研究了加入硝酸钾和有机肥对石油污染土壤进行修复时，不同微生物类群对十六烷的利用特征. 结果表明，与自然降解（CC）相比，加入KNO3（CN）和施入有机肥（CY）的处理均可提高土壤中十六烷的去除效率. 修复30 d时，土壤中十六烷的去除率由6.14% (CC)提高至13.6% (CN) 和15.0% (CY). 加入硝酸钾修复使得土壤微生物总量略有降低（总PLFAs由82.8 nmol·g−1（CC）降低至79.7 nmol·g−1（CN）），但被微生物同化为细胞组分的十六烷含量(13C-PLFA)由81.12 ng·g−1（CC）增加至92.84 ng·g−1（CN），硝酸钾生物刺激修复提高了革兰氏阳性菌和真菌对十六烷的同化代谢作用. 加入有机肥修复的土壤中，微生物总量（总PLFAs为99.3 nmol·g−1）和微生物同化代谢十六烷的含量均明显增加（13C-PLFA 为142.67 ng·g−1），土壤中革兰氏阳性菌和放线菌对十六烷的同化代谢作用明显增强. 在不同修复处理的土壤中，可利用十六烷的主要微生物有G+菌i15：0和a15：0、G-菌16：1ω5c和16：1ω7c、真菌18：1ω9c、放线菌16：0(10Me)和Unspecific菌16：00. 结果表明，革兰氏阳性菌是不同修复处理中最主要的十六烷降解菌，两种修复剂对土壤不同微生物类群的代谢激活作用存在差异.Abstract: Biostimulation by adding exogenous nitrogen to the soil is a common application technology for soil organic pollution. However, the metabolic characteristics of soil microbial communities towards the contaminants during the remediation are still not clear. In this study, two stimulants, KNO3 and compost, were applied to 13C-labeled hexadecane-contaminated soil for 30 days of remediation. The removal rates of hexadecane were determined using GC-MS, and the phospholipid fatty acid ( PLFA) contents and the 13C incorporated into PLFA was quantified using 13C -PLFA-SIP technique．Results showed that the removal rates of hexadecane was higher in the KNO3（CN）and compost (CY) amendment soils than that in the natural attenuation(CC). After 30 days of incubations, the removal rates of hexadecane enhanced from 6.14% (CC) to 13.6% (CN) and 15.0% (CY), respectively. Although KNO3 amendment slightly decreased the total microbial biomass (the total PLFAs changed from 82.8 nmol·g−1 in CC to 79.7 nmol·g−1 in CN), the 13C-PLFA increased from 81.12 ng·g−1 to 92.84 ng·g−1. KNO3 amendment improved the hexadecane assimilation utilization by Gram-positive bacteria and fungi. In the compost treated soil (CY), the total PLFAs and 13C-PLFA increased to 99.3 nmol·g−1 and 142.67 ng·g−1, respectively, and the assimilation utilization of hexadecane by Gram-positive bacteria and actinomycetes were significantly enhanced. In the different treatments, the microorganisms that can use hexadecane mainly included gram-positive bacteria i15:0 and a15:0, gram-negative bacteria 16:1ω5c and 16:1ω7c, fungus 18:1ω9c, actinomycetes 16:0 (10Me), and unspecified bacteria 16:00. The results indicated that gram-positive bacteria were the most dominant hydrocarbon-degrading bacteria in the different treatments, and the remediation characterictics of KNO3 or compost addition toward hydrocarbon-polluted soil were different.
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汞（Hg）是一种毒性很强的重金属污染物，具有高迁移性和生物积累性，极易渗透进入食物链，且难以进行有效控制[1-2]. 汞向环境中排放实际上是一个不可逆过程，因此，即便是长期低剂量的汞排放也可能会导致严重的环境问题和健康后果[3]. 人为排放是环境中汞的最主要来源，我国每年汞排放量约为500—1000 t之间，1976—2000年期间农田土壤中的平均汞浓度为0.25（0.01—1.65）mg·kg−1， 2006—2010年期间上升至0.47（0.0009—71.09）mg·kg−1，2011—2016年略有下降[4]. 《全国土壤污染状况调查公报》[5]显示我国土壤汞点位超标率达1.6％，其中汞矿区和工业区土壤受污染程度最为严重，其总汞含量远高于我国土壤汞含量的最大限制值1.5 mg·kg−1（GB 15618—2018）. 汞的毒性与其化学形态密切相关，无机汞对人体的毒性相对较弱，但其在特殊环境条件下能转化成毒性更强的甲基汞（MeHg）. MeHg是一种毒性极强的有机汞化合物，通过食物链富集进入生物体内，会对中枢神经系统造成极大危害. 国际上普遍认为MeHg暴露的主要途径为食用水产品[6]，有研究揭示汞矿等污染区域人群存在食用稻米造成的MeHg暴露健康风险问题[7]，这一发现打破了原有认知. 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，稻田由于季节性淹水灌溉，为汞甲基化提供了有利条件[8-9]，土壤有机质、pH以及微生物均有可能影响土壤中汞的甲基化. 水稻MeHg污染问题已经引起国际社会的高度关注. 据调查发现[10]，我国受汞污染农田达3.2万 hm2，每年生产的汞超标大米约有1.85亿 kg，对居民健康构成潜在威胁.
溶解性有机质（DOM）[11]主要来自于动植物残体分解，其结构复杂，含有多种官能团. DOM作为自然界中重要的活性组分，能通过吸附、络合、离子交换等方式影响汞在土壤中的迁移转化[12-13]，尤其是汞向MeHg的转变. 此外，DOM也会改变沉积物的Eh、pH[14]、微生物群落结构，从而影响汞的转移和生物可利用性. 目前，关于DOM对汞甲基化影响研究尚存分歧. 有研究表明DOM能显著降低汞的生物有效性和甲基化过程[15]. DOM含有丰富的金属结合位点，易与Hg2+结合，能增强光化学反应中Hg2+转化为Hg0的过程[16-17]，降低生物可利用的汞浓度，从而抑制MeHg产生[2]. 也有部分研究表明，DOM能促进汞甲基化. 水体中DOM含量增加，为汞甲基化过程提供充足的甲基供体，促进汞甲基化发生. 另一方面，DOM与汞的络合产物在一定程度上也更易被微生物同化利用，进而促进MeHg的形成[18]. 此外，何杉杉等[19]研究发现，DOM的腐殖化程度会影响汞的甲基化，长期进行渔业养殖活动的水体DOM腐殖化程度更高[20]，MeHg含量及甲基化速率普遍高于养殖时间较短的水体. 陈春羽等[21]提取3种不同来源DOM，研究其对土壤中汞的吸附行为影响. 结果表明，不同来源的DOM对土壤中汞的吸附行为抑制作用有明显差异. 何鑫龙等[22]对渔业养殖区不同来源有机物对水体中汞甲基化影响展开研究，证实了不同来源和组成的DOM对汞甲基化影响不同.
受国家倡导绿色发展理念以及全面推行化肥减施宏观战略的影响，不难预见绿肥、厩肥、圈肥等有机肥的需求将大幅增加[23]. 满江红[24] （Azolla imbricata ）是一种常见的水生蕨类植物，常见于水田、池塘等地，具有生长快、产量高、能与蓝藻共生固氮、富钾等生理特点，我国浙江、贵州、四川等南方省份常将其用作稻田绿肥. 已有研究表明，满江红在修复水体和资源化利用等方面存在诸多优势[25]. Cohen-Shoel等[26]采用含Sr2+溶液的模型研究满江红与重金属离子结合交换的机制，发现满江红细胞壁中的阳离子结合基团如羧基、磷酸基团等对重金属离子具有较高的亲和力，解释了满江红对重金属的吸附机理. 无生命的干燥满江红已被证明能从水溶液中结合重金属[27]，包括Cs、Sr、Ce等，其重金属结合积累能力是活体满江红的7倍左右. 综上，现有的研究主要集中在满江红的生态环境修复价值以及其开发利用[28-29]，而对于满江红腐解后的残体对重金属有效性的影响研究较为鲜见，其对汞甲基化是否存在促进或者抑制效应也未见报道. 从理论上说，满江红作为水生植物，当其进入衰亡期后，大量植物残体通过分解、淋溶进入水体，势必产生大量的DOM，对一些重金属污染物的环境化学行为产生影响. 因此，有必要对汞污染区域满江红腐解过程中DOM的化学行为特征进行系统的研究. 在有机质腐解过程中，其结构与组成不断发生改变，因此从更微观的角度切入探究DOM对汞甲基化的影响更具现实意义.
本研究以稻田满江红DOM为研究对象，探究在稻田体系中满江红DOM对汞甲基化的影响，同时结合光谱分析与亚组分分离技术，从微观角度探究满江红DOM影响汞甲基化的作用机制及其贡献度，以期为提高汞污染农田生产安全性提供理论依据.
1. 材料与方法（Materials and methods）
1.1 样品采集与处理
供试材料新鲜满江红购买自浙江省金华市江东镇竹文园艺经营部. 用去离子水清洗去除杂质，沥干后备用. 分别称取400 g新鲜满江红至6个2 L烧杯中，每个烧杯中加入1 L超纯水，放入厌氧培养箱中恒温培养，模拟稻田活体满江红腐解过程.
分别在腐解开始后的0 、15 、30、60 、90 、120 d取出样品，冷冻干燥后充分研磨. 采用水浸提法[30-31]提取满江红DOM，将1 g满江红与30 mL超纯水混合后，在25 ℃恒温培养箱中振荡24 h，18000 r·min−1高速离心30 min，取上层清液过0.45 μm滤膜，过滤后液体即为满江红DOM，放置于4 ℃冰箱中保存备用.
1.2 DOM光谱测定
1.2.1 3D-EEM光谱
三维荧光光谱测定采用日立F-7000型荧光分光光度计，激发光源为150 W氙灯，PMT电压为700 V，激发波长扫描范围230—450 nm，发射波长扫描范围250—620 nm，狭缝宽度和增量均设为5 nm，响应速度为自动，扫描速度设为2400 nm·min−1. 以超纯水为空白，扣除拉曼和瑞利散射，测定过程中保持温度恒定.
1.2.2 UV-Vis光谱
紫外光谱测定采用岛津紫外可见分光光度计UV-2600，扫描波长为230—800 nm，扫描间隔为1 nm，将254 nm处的吸光强度与DOC的比值记为SUVA254，S275—295和S350—400分别代表275—295 nm和350—400 nm波长范围内的曲线斜率，将S275—295/S350—400的比值计为SR.
1.3 DOM亚组分分离
本研究采用Amberlite XAD-8、XAD-4大孔树脂、BIO-RAD AG-MP-50饱和阳离子交换树脂、DUOLITE A-7阴离子交换树脂，根据DOM在不同树脂上吸附能力的差异，将其分离成疏水碱性物（HOB）、疏水酸性物（HOA）、疏水中性物（HON）、亲水碱性物（HIB）、亲水酸性物（HIA）、亲水中性物（HIN）6种有机组分.
1.3.1 树脂柱预处理
用3倍树脂体积（约200 mL）的95％乙醇分别清洗Amberlite XAD-8、XAD-4大孔树脂，后用超纯水淋洗至流出液无醇味. 用50 ℃的超纯水反复浸洗阳离子和阴离子树脂，洗至浸洗液无色后将树脂装入树脂柱，用浓度为5％的氢氧化钠（NaOH）和盐酸（HCl）进行二次清洗，以酸-水-碱-水-酸的顺序清洗阳离子交换树脂，以碱-水-酸-水-碱的顺序清洗阴离子交换树脂，最后用超纯水清洗至中性，处理后的树脂密封保存.
1.3.2 DOM亚组分分离
组分分离参照Leenheer等[32-33]方法并加以改进，通过蠕动进样泵将DOM加入XAD-8/XAD-4树脂柱中，用0.01 mol·L−1和0.10 mol·L−1的HCl反洗XAD-8树脂柱得到组分HOB，XAD-8/XAD-4流出废水酸化至pH=2，然后通过柱回收，将XAD-8树脂取出自然风干，用甲醇索式提取得到HON. 将脱附混合物进一步过柱，用0.10 mol·L−1 NaOH反洗XAD-8树脂后获得HOA. 由于几乎所有的亲水小分子都被吸附在XAD-4上，因此使用NaOH脱附有机质，调节pH后泵入阴离子交换树脂，用0.10 mol·L−1氨水（NH4OH）反洗得到HIB，流出物泵入阳离子交换树脂，用3.00 mol·L−1的NH4OH反洗得到HIA，HIN通过用纯水淋洗阳离子交换树脂后获得. 所有获得的亚组分用旋转蒸发仪在40 ℃下干燥[34].
1.4 不同腐解时间DOM及亚组分对汞甲基化的影响
测定不同腐解时间（0、15 、30、60、90、120 d）DOM及其亚组分的DOC浓度，稀释至相同浓度2.5 mg·L−1，配制1000 ng·L−1的硝酸汞（Hg(NO3)2）溶液，在100 mL离心管中加入50 mL的DOM或亚组分溶液和25 mL Hg2+溶液，在常温黑暗条件下培养24 h.
采用蒋红梅等[35]建立的方法（蒸馏-乙基化结合气相色谱-冷原子荧光，CVAFS法）在BROOKS RAND测汞仪上测定MeHg质量浓度（方法回收率为88.2%—108.4%，方法空白为（0.045±0.003）ng·L−1，最低检出限为0.009 ng·L−1）. 取培养好的样品于聚四氟乙烯蒸馏瓶中，125 ℃蒸馏，使MeHg富集于接收瓶中. 将蒸馏液转移到气泡瓶中并定容至80 mL，加入乙酸-乙酸钠（HAc-NaAc）缓冲溶液和四乙基硼酸钠（NaBEt4）试剂，密闭反应一段时间通入氮气，使MeHg富集在Tenax管上，测定样品中的MeHg含量. 本试验测定的重复样品的相对标准偏差＜9%.
1.5 数据处理与分析
光谱数据分析采用MATLAB R2020b软件，由SPSS 26进行数据统计分析，P<0.05表示各组处理之间存在显著差异，数据处理采用Excel 2019，图表制作采用Origin 2019.
2. 结果与讨论（Results and discussion）
2.1 不同腐解时间满江红DOM及其亚组分对汞甲基化的影响
腐解过程满江红DOM可溶性有机碳（DOC）浓度量呈现不规则变化（表1）. 腐解初始时（0 d）的满江红DOC值最大. 腐解前15 d，DOC有明显的快速下降趋势. 15—30 d逐渐增大，随后DOC整体呈下降趋势. 图1为不同腐解时间满江红DOM对汞甲基化影响结果. 未添加DOM对照组MeHg产生量为0.0213 ng·L−1，添加DOM实验组MeHg产生量高于对照组，说明不同腐解时间满江红DOM均能促进汞甲基化. 其中未腐解满江红DOM促汞甲基化能力最强，溶液MeHg为0.09 ng·L−1，随腐解进行，MeHg产生量出现先降低后升高后逐渐平稳的趋势. 腐解第15 d MeHg产生量及转化率最低，随腐解时间增加而增加，总体在0.072％—0.078％左右. 图2为不同腐解时间满江红DOM亚组分对汞甲基化影响结果，可以发现不同腐解时间生成的DOM亚组分影响汞甲基化能力不同. 6个组分中HOB对汞甲基化促进效果最强，显著促进了MeHg的产生，其中0 d HOB 促进MeHg生成的效果最为明显，产生的MeHg高达0.32 ng·L−1，而后随着腐解时间呈现先下降后上升的趋势. HOA与HON促汞甲基化能力相近，腐解初期MeHg产生量较高，随腐解进行不断下降，腐解后期基本不变. 相比而言HIA、HIB、HIN 3个亲水性组分促汞甲基化能力较弱，HIB对汞甲基化影响呈现不规则波动，HIA和HIN前期对汞甲基化影响基本保持稳定，腐解第30 天后HIN、第90 天后的HIA未能检测到MeHg生产，说明其促汞甲基化能力消失.
表 1 不同腐解时间满江红DOM的DOC变化情况Table 1. Variation of the DOM derived from A. imbricata in different decomposition time腐解时间/d Decomposition time 0 15 30 60 90 120 DOCDOM/（mg·L−1） 2010 1548 1724 1362 1016 946 | Show Table
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图 1 不同腐解时间满江红DOM对MeHg产生量及转化率的影响Figure 1. Production and conversion rate of MeHg by DOM derived from A. imbricata at different decomposition time
图 2 不同腐解时间满江红DOM亚组分对MeHg产生量影响（针对单一腐解时间进行不同DOM亚组分差异分析）Figure 2. Production of MeHg by the DOM sub-fractions derived from A. imbricata at different decomposition time（This diagram shows the difference of sub-fractions DOM derived from A. imbricata for a single decomposition time）2.2 不同腐解时间满江红DOM的光谱特征
2.2.1 UV-Vis光谱
显色溶解性有机质（CDOM）是DOM中的可吸光部分，在水体光场的测定中发挥着重要作用[36-37]，常用吸收系数a（355）来表征CDOM的浓度，吸收系数越大，CDOM含量越高. 表2可以看出随腐解进行满江红DOM中CDOM处于动态变化，腐解前期CDOM含量显著下降，后期逐渐增大. 这可能是由于腐解前期受到微生物降解、金属离子共沉淀、水解等去除作用导致其浓度降低. 腐解后期降解速率减慢，CDOM逐渐累积. 光谱斜率比值（SR）常用来评估DOM结构变化[38]，SR值与分子量呈反比. 随腐解进行，DOM的SR值先增大后减小，即腐解过程中前期以小分子DOM为主，后期大分子DOM居多. SUVA254为254 nm处吸收系数与DOC浓度的比值，用于表征DOM芳香性大小，SUVA254值越大表明DOM的芳香化程度越高，其苯环结构数量更多且更加复杂.
表 2 不同腐解时间满江红DOM紫外吸收光谱参数Table 2. Spectral parameters of UV absorption of the DOM derived from A. imbricata at different decomposition time腐解时间/d Decomposition time S275—295 S350—400 SR SUVA254 a（355）/m−1 0 0.0111 0.0242 0.4584 35.9422 10.8441 15 0.0328 0.0512 0.6409 6.9077 1.6118 30 0.0413 0.0319 1.2935 8.7498 0.6908 60 0.0380 0.0267 1.4260 10.3616 1.6118 90 0.0181 0.0184 0.9841 15.8439 3.6403 120 0.0108 0.0245 0.4415 13.8922 4.2214 | Show TableDownLoad:
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根据表2将整个腐解过程大致分为3个阶段，第一阶段（0—15 d）属于组分的净消耗阶段，这一阶段中微生物大量繁殖，同时大量消耗氨基酸、单糖、多糖等物质. 0 d 满江红DOM的SUVA254最高，后续随实验进行经历了一个骤降缓升的过程. 腐解初期碳水化合物初始含量较低时，芳香性化合物如木质素分解产物等也可作为微生物的能量和碳源被消耗，导致SUVA254降低. He等[39]研究微生物降解大型植物中DOM的浸出过程，也发现腐解初期微生物种群数量增幅最大. Chen等[40]发现，腐解过程物质代谢沿不同生化途径进行，不同阶段腐解产物存在差异，腐解初期产生的芳香性物质主要为直链脂肪酯类，结构较为简单，能被作为底物消耗[41]，而带有较为复杂的芳环结构的难降解芳香族化合物才是腐解后期DOM中的优势组分，难以被微生物利用. 第二阶段（15—60 d）属于快速分解期，SUVA254随腐解时间逐渐增大，芳香性组分富集，小分子量DOM增多. 此阶段中纤维素、木质素等被微生物分解成大量单糖、寡糖等小分子物质以及大量难降解的芳香族化合物，Dilling等[42]研究证实，木质素分解会产生大量芳香性物质，降解产物相对富集，芳香性物质逐渐占据主导地位. 第三阶段（60 d以后）属于准平衡阶段，分子量和SUVA254整体增大，这一阶段腐解速率减慢，高生物可利用性的组分例如碳水化合物，有机酸等逐步被微生物消耗，难降解的芳香性和大分子物质被保留[43]. 这与Almendros等[44]研究土壤衍生腐殖酸生物降解的发现一致，由于形成的芳香性物质结构趋向复杂，生物可降解性降低，其含量的总体变化趋势为逐渐增加.
2.2.2 3D-EEM光谱
三维荧光光谱（3D-EEM）技术常用于对溶解性有机质进行表征，不同来源的DOM荧光峰和强度存在差异[45]. 图3为不同腐解时期满江红DOM的三维荧光光谱图，本研究共识别出5个荧光峰，荧光峰A（Ex/Em=260 nm/380 nm）为紫外光区类腐殖质荧光峰；荧光峰B（Ex/Em=275 nm/320 nm）为类酪氨酸荧光峰；荧光峰C（Ex/Em=335 nm/420 nm）为可见光区类腐殖质荧光峰；荧光峰M（Ex/Em=320 nm/406 nm）为微生物源类腐殖质荧光峰；荧光峰T（Ex/Em=275 nm/330 nm）为类色氨酸荧光峰. 根据表3荧光光谱参数所示，类蛋白组分荧光强度较大，说明腐解过程中类蛋白质物质占主导地位，随着腐解时间增加，荧光峰数量和位置保持不变，但峰强度在前90 天随着时间的增长而增大，120 d峰强度降低.
图 3 不同腐解时间满江红DOM三维荧光光谱图Figure 3. Three-dimensional fluorescence spectra of the DOM derived from A. imbricata at different decomposition times表 3 不同腐解时间满江红DOM荧光光谱参数Table 3. Fluorescence spectral parameters of the DOM derived from A. imbricata at different decomposition time腐解时间/d Decomposition time 0 15 30 60 90 120 荧光峰强度 Fluorescence intensity B 761.44 1604.17 2009.44 3404.49 4652.30 2980.78 T 930.53 1221.73 1473.73 2529.73 3686.73 2976.73 A 192.98 195.24 205.64 351.54 502.74 512.44 M 312.49 397.19 431.59 704.79 986.69 952.49 C 81.03 22.40 24.44 67.47 169.00 111.34 荧光参数 Fluorescence parameter FI 2.40 1.86 2.43 2.42 2.42 2.48 BIX 0.54 1.67 1.51 1.61 0.96 1.06 HIX 0.47 0.07 0.08 0.10 0.15 0.23 | Show TableDownLoad:
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荧光指数（FI）指的是当Ex=370 nm时，Em=470 nm与Em=520 nm的荧光强度的比值. 该指标用于指示DOM中类腐殖质来源，外源和内源DOM的两个端源FI值分别为1.4和1.9[46]. 当FI＞1.9时，DOM主要源于细菌和藻类活动，自生源特征明显. FI＜1.4时，主要是外源（陆源）输入为主，异生源特征明显. 不同腐解时间满江红DOM的FI均接近或大于1.9，表明其DOM中的类腐殖质主要是内源分解产生.
生物指数（BIX）指的是当Ex=310 nm时，Em=380 nm与Em=430 nm处的荧光强度的比值[47-48]. 该指标可以反映某一微域生物活动强度、DOM来源等，当BIX＞1时，DOM主要以生物源为主，包括动植物残体降解产物；当BIX值较低时，DOM主要以陆源输入为主. 如表3所示，未腐解的BIX为0.54，代表其主要以陆源输入为主，自生源贡献较少，腐解后满江红DOM的BIX大于1，表明DOM主要以自生源为主，且多为最新产生.
腐殖化指数（HIX）为当Ex=254 nm时，Em=435—480 nm范围内的积分面积与Em=300—345 nm范围内的积分面积之比，是应用于表征有机质腐殖化程度的指标，也常用来衡量DOM分子的复杂性[49]. Ohno[30]的研究显示HIX值在0—1间变动,其值越大表明样品腐殖化程度越高，0 d满江红DOM的腐殖化程度最大，随着腐解时间腐殖化程度先下降后不断增大.
尽管三维荧光光谱能提供一些DOM组分信息，但仍无法定量判别DOM荧光特性，因此，采用区域体积积分法（FRI）对不同腐解时间满江红DOM的荧光特性进行定量表征. 根据Chen等[50]提出的FRI法，通过不同的激发和发射波长，将DOM划分成5个荧光区域，其中I区、II区和IV区的荧光物质与类蛋白物质有关，III区和V区的荧光物质与类腐殖质有关. 对比表4不同区域荧光峰体积可以发现，腐解初期，类蛋白物质含量显著增量，在90 d达到最大，随后有少量减少. 而类腐殖质物质在腐解前期略有下降，后随着腐解时间增长不断增多. 有研究者[51]认为，腐解前期类腐殖质含量下降，可能是由于水中仍含有部分氧，导致其在氧化条件下更易被氧化降解，转变为分子量更小的物质，为微生物的生长提供碳源. 随着腐解的进行，水体中溶解氧含量急剧下降，微生物代谢对DOM的降解作用减缓[39]，类腐殖质逐渐累积[52].
表 4 不同腐解时间满江红DOM三维荧光光谱区域积分值（×104 au·nm2）Table 4. FRI of three-dimensional fluorescence spectrum of the DOM derived from A. imbricata at different decomposition time腐解时间/dDecomposition time 0 15 30 60 90 120 Ⅰ（芳香族蛋白类Ⅰ） Aromatic ProteinⅠ 52.62 149.35 178.204 216.85 348.50 226.01 Ⅱ（芳香族蛋白类Ⅱ） Aromatic ProteinⅡ 96.10 111.44 131.38 223.63 397.14 355.77 Ⅲ（富里酸类） Fulvic acid-like 23.51 21.82 25.722 40.80 75.99 74.85 Ⅳ（溶解性微生物副产物类） Soluble microbial by-product-like 43.43 87.24 98.89 168.75 216.473 156.29 Ⅴ（腐殖酸类） Humic acid-like 11.05 8.46 9.78 15.322 26.30 22.92 | Show TableDownLoad:
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结合紫外与三维荧光光谱对不同腐解时期满江红DOM及其亚组分对汞甲基化的影响进行分析. 结果表明，不同腐解时期满江红DOM的DOC浓度大小与其汞甲基化能力无相关性. 0 d满江红DOM的芳香性最大，溶液MeHg产生量也显著高于腐解后的，腐解0—15 d，由于芳香性物质大量减少，DOM对汞甲基化的促进作用也显著减弱，腐解中后期芳香性物质不断增加，此期间满江红DOM对汞甲基化的促进作用也随之增大，之后基本保持稳定. Lavoie等[53]研究证实，DOC浓度会影响水体中MeHg含量，但并非MeHg产生的唯一影响因素，相较于DOC浓度，Burns等[54]通过SUVA254测量发现，芳香性物质是影响汞甲基化的重要因素[55]，高芳香性物质含有丰富的还原性硫结合位点，有利于稳定HgS纳米颗粒，促进汞甲基化. 同时分子量大小也会影响DOM促汞甲基化能力[56]. Hisamitus等[57]研究发现不同分子量的DOM促汞甲基化能力不同，分子量较小的DOM具有更高的活性，在汞甲基化过程中起主要作用. 本实验中DOM分子量随腐解时间表现出先减小后增大的趋势，腐解30—60 d小分子量DOM较多，对汞甲基化促进作用较强. 满江红腐解过程中类蛋白质组分占主导地位，类腐殖质物质在腐解过程中呈现先减少后增多的趋势，类腐殖质作为重要的甲基供体，对促进汞的非生物甲基化过程有重要作用，腐解15 d时，类腐殖质物质含量相对较少，溶液MeHg产生量也相对较少. 随腐解时间类腐殖质物质逐步积累，DOM促汞甲基化能力也有所增强. 文献[58-60]表明，DOM中的类蛋白质物质是Hg的强配位体之一，类蛋白质组分更易与Hg2+结合，继而促进甲基汞生成，也有研究发现部分类腐殖质物质能够直接参与汞的非生物甲基化. 未腐解满江红DOM类蛋白质组分低于腐解后的DOM，但其芳香性和腐殖化程度显著高于腐解后满江红DOM，这一定程度促进了MeHg的产生.
亚组分促汞甲基化试验研究表明，疏水性组分促汞甲基化的能力强于亲水性组分. 这主要是由于不同亚组分间差异，导致其与汞结合能力不同，研究[61]表明芳香性物质几乎全部存在于疏水组分中，使得DOM更易与Hg2+之间发生电子迁移反应，进而促进汞甲基化反应进行[62]. Guggenberger等[63]的研究发现，亲水性酸性物质对金属离子有较强的络合能力，是疏水性性物质的2—8倍. 相比于疏水组分，亲水组分更易与金属离子发生聚集和沉淀[64-65]，表现出胶体颗粒特征，进一步影响Hg的迁移转化. 在本研究中亲水性有机组分也显示出相同的情况，对汞甲基化的促进效果弱于疏水性有机组分.
3. 结论（Conclusion）
（1）满江红DOM对汞甲基化具有促进作用. 未腐解满江红DOM促汞甲基化能力最强，达到0.09 ng·L−1，随腐解时间表现出先降低后增加的趋势，腐解15 d MeHg产生量及转化率均为最低，腐解后期基本稳定. 6种组分中HOB对汞甲基化促进效果最强，亲水性组分对汞甲基化促进效果较弱，腐解后期HIA、HIN等组分对汞甲基化无促进作用.
（2）腐解过程分为三阶段，第一阶段（0—15 d）微生物大量繁殖，碳水化合物及简单芳香性物质被消耗. 第二阶段（15—60 d）纤维素、木质素等被微生物分解成小分子物质以及大量难降解芳香族化合物，芳香性物质逐渐富集. 第三阶段（60 —120 d）碳水化合物、有机酸等逐步被微生物消耗，难降解芳香性物质和大分子物质保留. DOM中类蛋白质物质占比较大，随腐解时间不断增多，90 d后有少量下降，类腐殖质物质含量呈现先降低后升高的趋势.
（3）满江红DOM促汞甲基化能力受芳香性、分子量大小、类蛋白质组分含量等因素影响，高芳香性、小分子量DOM促进MeHg产生. 疏水性组分含有大量芳香性物质，使得其对汞甲基化的促进作用显著高于亲水性组分. 亲水性组分的强络合能力使金属离子更易发生聚集和沉淀，促汞甲基化能力较弱.
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图 1 不同修复处理下土壤中十六烷含量(a)及降解率(b)
Figure 1. Soil hexadecane contents(a) and degradation rates(b) in different treatments
图 2 不同修复处理土壤微生物的特征PLFAs含量
Figure 2. The content of microbial PLFAs in different treatments
图 3 不同处理下土壤PLFA单体含量
Figure 3. The contents of microbial PLFA monomer in different treatments
图 4 不同处理下土壤PLFA单体中13C含量
Figure 4. The amount of 13C-PLFA in microbial monomers PLFA in different treatments （Different lowercase letters represent significant differences in 13C-PLFA content in different time （P<0.05）; different uppercase letters represent significant differences in 13C-PLFA content in different treatments at the same period （P<0.05））
图 5 不同处理下土壤微生物类群中13C含量
Figure 5. The amount of 13C-PLFA in microbiota in different treatments
图 6 修复30 d时不同处理土壤中各微生物类群PLFA利用13C的相对丰度
Figure 6. The relative abundance of 13C incorporated in microbial PLFAs in different treatments
表 1 土壤基本性质
Table 1. Basic physicochemical properties of soil
pH 含水率/%Humanity 有机碳/（g·kg−1）Organic carbon 总氮/（mg·kg−1）Total nitrogen 铵氮/（mg·kg−1）NH4+-N 硝氮/（mg·kg−1）NO3--N 全硫/（mg·kg−1）Total sulfur 碳氮比C/N 8.20±0.04 0.12±0.01 17.1±1.27 400.1±12.5 4.11±0.16 4.01±0.15 120.0±8.9 42.5
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表 2 实验方案设计
Table 2. Experimental scheme design
编号 Code 处理 Treatment CC 100 g洁净土壤+0.5 g 13C-十六烷 CN 100 g洁净土壤+0.5 g 13C-十六烷+0.3066 g KNO3（C/N=10/1） CY 100 g洁净土壤+ 0.5 g 13C-十六烷+15 g 有机肥（C/N=10/1）
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表 3 不同修复处理土壤细菌 /真菌、革兰氏阳性菌 /革兰氏阴性菌PLFA比值的变化
Table 3. The ratios of bacteria to fungi and gram-positive to gram-negative bacteria under different treatments
处理Treatment 细菌/真菌Bacteria/Fungi 革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌G+/G− 0 d 3 d 30 d 0 d 3 d 30 d CC 7.97±0.02aA 7.82±0.03aA 7.97±0.01aA 0.56±0.01aA 0.54±0.03aA 0.55±0.04aA CN 7.49±0.11bA 7.89±0.04aB 7.61±0.05aAB 0.56±0.04aA 0.55±0.02aA 0.53±0.06aA CY 8.35±0.16cA 7.72±0.21aB 7.87±0.07aC 0.60±0.05bA 0.62±0.02bA 0.61±0.04bA 注：小写字母为同一时期不同修复之间差异性, 大写字母表示同一处理不同时期差异性, 字母不同表示差异显著（P<0.05）. Different lowercase letters indicated significant differences among different treatments （P<0.05）; different uppercase letters represent significant differences in different remediation periods in the same treatments（P<0.05）
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