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自2001年Daughton提出“污水分析”的概念后，美国首次研究了污水中苯丙胺的含量，ZUCCATO等将其应用并发展成“污水流行病学”，用以估算人口中可卡因的消费量，并迅速被拓展到其他非法药物的滥用监测中[1,2]. 2010年，欧洲污水分析核心小组（SCORE）成立，旨在建立污水分析和协调研究的标准化方法[3]. 近年来，污水流行病学已经在世界范围内得到广泛应用，并证明了其在量化不同时间和空间范围内毒品滥用中的巨大潜力. 相较于其他方法，该方法具有明显优势：非侵入式、接近实时监测，且不受反应偏差影响，既可以研究长期[4]、短期或特殊日期、事件期间特定地区的毒品滥用变动[5 − 6]，也可以比较不同地区的毒情严重程度[7]，还可以对新精神活性物质进行监测[8]. 但该方法也存在一定局限性，如无法准确提供使用频率、吸食途径、主要使用者和药物纯度等信息[9 − 11]. 同时，分析结果与污水采样、生物标志物选择、分析过程可靠性、校正因子以及人口规模估算等参数具有很大关系，可能造成较大的不确定性[12 − 14].
因此迫切需要通过分析每一步的不确定度来源，通过研究改进提高结果的准确度. 鉴于甲基苯丙胺（methamphetamine, MAMP）是国内滥用程度最严重，同时研究最为广泛的毒品，本文以近3年污水流行病学关于MAMP的研究为切入点（在web of science上以主题为“methamphetamine”和“wastewater-based epidemiology or sewage-based epidemiology”，发表日期为“2019年以来”进行检索，经排查研究内容有效文献为80篇），系统梳理本领域最新研究进展和当前存在的主要问题，为进一步完善技术方法提供有益参考.
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污水流行病学的基本原理是人类摄入的物质会以原体或代谢物的形式从尿液或粪便中排出，最终进入下水管道. 通过污水中目标残留物可以识别人群对特定物质的使用情况. 由于污水流行病学的非侵入性和近乎实时性以及毒品滥用的隐蔽性，利用该方法进行毒品滥用监测在全世界范围内得到广泛应用，方案如图1所示.
首先，对污水进行代表性采样和分析；随后用代谢目标物浓度和污水流量得到其质量流量，应考虑区分干扰性代谢目标物来源；根据毒品原体和代谢目标物的代谢比例计算校正因子，结合代谢目标物的稳定性，计算毒品消耗量；根据人口估算，计算人均消耗量. 此外，还可结合吸毒人员吸食频次和剂量，得到毒品的流行率.
早期研究中，各研究小组采用不同的操作过程和分析方法，因此很难进行系统比较研究. 为此，SCORE建立了污水分析和协调研究的标准化方法（表1）并在全欧洲范围内开展毒品滥用的区域性差异调查. 但采样、前处理与分析、代谢目标物稳定性、反算过程参数（如校正因子、人口数量、吸食频次和剂量等）等因素，以及未经吸食而直接倾倒毒品、制造毒品、吸食可代谢为生物标志物的合法药物等行为都会引起研判结果的不确定性[7].
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市政污水流量受天气、季节以及居民用水习惯、各种集体活动等条件影响而动态变化，部分研究中还可能存在目标物的瞬间污水脉冲. 因此，采样模式、采样位置和采样量等的选择不仅与研究目标有关，更是分析结果不确定度的重要来源.
当前，常见的污水采样模式有连续采样法和非连续采样法，见表2. 连续采样法包括流量等比例和恒量连续采样；非连续采样法包括等时等体积、等时等流量、流量等比例和随机抽取采样. 流量等比例是指采样体积随流量实时等比例变化，恒量连续采样是指以固定体积连续采样，等时等体积是指每隔固定时间采固定体积样品，等时等流量是指每隔固定时间按照即时流量等比例采样，流量等比例是指每隔固定流量采集固定体积样品，随机抽取采样是指随机抽取. 由于污水处理厂的流量、目标物的种类和浓度等在不同时间段存在差异，因此污水流行病学采集水样通常是24 h混合样品，且一般避开降雨等特殊天气.
ORT等[17]比较了不同采样模式的不确定性，结果表明流量等比例连续采样为最佳采样方法，可消除因流量、毒品种类和浓度不同而导致的误差. 但事实上，未发现有文献采用流量等比例连续采样（图2A），这可能与污水厂采样装置的配备有关. 如果要研究长期或短期内目标物变化趋势，需遵循高频率等时等流量方法采样. 为降低流量测定带来的不确定度，可以采用与流量相关的生物标志物进行人口规模估算，或者采用被动采样[18 − 19]. 被动采样可在较长的研究时间内实现目标物自动吸附，而无需采集多个样品. 但是由于不同的目标物具有不同的吸收和扩散性质，因此，采样前应根据目标物性质选择合适的吸附材料，然后再将其部署在采样位置.
污水采样位置大多在进样口（图2B），特别是在粗格栅或细格栅之后和初沉淀池之前. 为研究不同处理过程对目标物浓度的影响，也有对不同位置污水进行采样，如在出水口位置采样一般则属于环境化学领域研究范畴. 根据目标物性质的不同，采样量也不同. 尽管有文献报道采样量仅50 mL，但因为某些排泄的非法药物在废水中的浓度相对较低，采样量过少时会影响结果的公正性和重复性. 一般而言，500 mL采样量能够保证常见毒品的分析，HUIZER[7]等将1 L的采样量作为结果可靠性评判的分界线.
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恰当的毒品代谢目标物是毒品滥用准确监测回溯的重要前提，一般具有以下特征：1）在污水中可以检出；2）仅因人类排泄而释放到下水道中；3）具有明确的排泄路径，避免其他外源性或内源性排泄干扰；4）对悬浮物吸附有限；5）在污水环境、采样、运输和分析过程中保持较高的稳定性[20 − 21].
MAMP主要以原体代谢，其次为苯丙胺（amphetamine, AMP）以及少量的对羟基甲基苯丙胺和对羟基苯丙胺[2]. 给药途径（鼻吸、烫吸、注射、口服或吸食工具）、给药频次、给药剂量、酒精、光学异构体以及个体差异等都会影响MAMP的代谢[2,22 − 23]. 例如，酒精共用、静脉注射、烫吸时原体代谢比例较高，但与烟丝混合烫吸时原体代谢比例降低至5%—17%[20].
MAMP原体和对羟基甲基苯丙胺最有可能作为代谢目标物[2]. 但对羟基甲基苯丙胺也是甲氧基甲基苯丙胺的代谢产物，且存在硫酸盐和游离态两种排泄形式. MAMP作为代谢目标物的主要缺点一是难以区分直接倾倒和吸食代谢，二是其他来源干扰[24]. 对于前者，BADE等[24]认为同时监测对羟基甲基苯丙胺和MAMP的比值有望解决. 对于后者，需要分析污水中MAMP所有来源，除MAMP原体代谢外，其还是苄非他明（Benzamphetamine, BAMP）、二甲基苯丙胺（Dimethylamphetamine, DMAMP）、泛普法宗（Famprofazone, FAMP）、呋芬雷司（Furfenorex, FURF）、芬特明（Phentermine）和司来吉兰（Selegiline, SELG）等药物的代谢产物（图3）. 值得注意的是，MAMP为手性分子，不同异构体代谢不同. 以SELG为例，其仅代谢R（-）MAMP. KHAN等[20]采用质量平衡物质流分析了美国等3个国家污水中MAMP的来源.
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污水中代谢目标物的含量往往极低，甚至比人体体液中含量低上千倍. 因此，足够特异、灵敏的检验技术是准确定性定量的根本保证. 在所调研文献中，所有文章都用到了色谱质谱技术.
气相色谱/质谱具有较高的选择性和灵敏度，但往往需要衍生化处理等，造成样品处理耗时费力，影响检测结果. 因此，在定量分析中，液相色谱/质谱的应用更为广泛（图4B）. 对于MAMP的研究，大多数通过电喷雾正离子模式进行. 四极杆离子阱、四极杆轨道阱、四极杆飞行时间和三重四极杆是最常用的技术，其中三重四极杆占据绝对主导地位. 除了对污水中MAMP等明确目标物进行分析外，飞行时间和轨道阱高分辨质谱还显示出靶向和非靶向分析的强大优势. 既可以研究潜在生物标志物，还可以研究新精神活性物质及在污水中的代谢产物，且同时适用于定性和定量检验[25].
由于污水中目标物含量极低且基质复杂多变，共洗脱成分可能在电离过程中产生离子抑制或干扰，影响定量结果. 因此，尽管色谱质谱等仪器具有很高的灵敏度，但为确保定性定量结果的准确可靠，样品的净化、目标物的浓缩等前处理步骤则必不可少. 固相萃取是当前应用最为广泛的技术，最常用的包括MCX或HLB柱（图4A），在线固相萃取和大体积进样为全自动分析提供了可能. 通过进一步提高色谱质谱灵敏度，并允许样品稀释或减少浓缩步骤，有助于解决基质效应问题. 同时，为准确定量分析，大多数文献采用同位素内标物（图4B）（如MAMP-D5、MAMP-D8等）通过添加同位素标准物质，补偿基质效应，尽可能降低样品定量分析误差. 值得注意的是，在实际工作中，相对于MAMP，很多新精神活性物质及其代谢物种类多、更新快，同位素内标很难获取，这也是限制新精神活性物质检验监测的关键因素.
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由污水流行病学原理可知，估算消费量的一个重要因素是目标物的稳定性[1]. 忽略目标物在污水收集系统、采样、运输和保存过程中可能会存在物理吸附、生物降解、水解等现象，可能会导致推算结果的偏差[26].
大多数文献采用仿真模拟研究温度、污水组成、固体颗粒吸附、生物膜的形成和解离对分析目标物降解转换的影响. 有研究发现，MAMP在固体颗粒吸附低于2.3%[3]. LI等[27]在300 m中试规模的污水管中进行模拟实验，评估了MAMP等7种违禁药物在上升管道和重力管道中的迁移和转化，并将校准的转化系数成功应用于污水管道中污水估算模型，但在真实环境下的稳定性仍需进一步研究确认.
分析目标物在采样及之后的存储过程的稳定性同样重要. 研究表明[24]，MAMP在中性室温条件下未过滤的污水等各种条件下均表现出良好的稳定性（图5），或在−20 ℃下保存123d的降解均低于10%[26]. 在给定具体条件的文献中，多数采用采样后调酸冷藏运输，冷冻保存（图4B）. 此外，多数毒品在冷冻和酸性条件下能保持稳定，由稳定性引起的不确定度一般低于10%[3].
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人口估算是反算毒品消费量的重要因素，而污水处理厂服务的实际人数可能由于通勤、季节、假期或特殊事件而随时间变化. 目前人口估算方式有静态人口，如容量设计、专家估计、人口调查和动态人口，如生物标记物、污水流量、水化学参数、手机信号[3,28 − 29]. 所调研文献中，多数采用人口调查和水化学参数进行人口估算（图6A）. 其中水化学参数中的化学需氧量、生物需氧量、总氮和总磷等物质的人均排放量较为固定，且可以通过反算消除流量测量偏差，因此常被用于人口估算[30]. 但该类物质并非人类特异代谢产生，而是人类生产或生活行为产生. 工业污水中往往携带大量该类物质，从而导致估算不准确. 尽管有文献提出利用手机通讯数据进行动态人口估算[31]，但DEVILLE等[31]发现与静态标准化数据相比，不确定度高达55%. 利用生物标志物估算人口数量相对准确，包括外源性或内源性物质，但尚无公认最适合的单一标志物来估算人口数量. RICO等[32]对比了安赛蜜、阿替洛尔、咖啡因、卡马西平、可待因、可替宁、肌酸、氢氯噻嗪、萘普生、水杨酸、羟基可替宁等12种尿液中人口标志物，其中可替宁、5-羟基吲哚乙酸和咖啡因与水化学参数所得人口数量较为一致. SENTA等[33]和RICO等[32]同样认为，可替宁适合作为人口估算生物标记物. 使用药物等外源性物质作为人口标志物的局限性在于药物只被特定人群使用，且比例很难确定，烟灰、烟蒂等处理方式差异也会造成估算偏差. 另一项重要不确定性来自于可替宁流行率的变化. 有研究表明，新冠肺炎疫情期间，西班牙和葡萄牙的烟草消费发生了显著变化.
相较而言，内源性物质具有同质排泄和低差异性的优势. 常见于报道的有肌酸酐、粪固醇、5-羟基吲哚乙酸和氨氮. CHIAIA等[34]首先尝试将尿液中的肌酸酐作为生物标志物，但其稳定性差. DAUGHTON等[35]推荐粪固醇作为生物标志物，但易被颗粒物吸附且人体排泄频率低的特性限制其应用. 相对于皮质醇和雄烯二酮，5-羟基吲哚乙酸在有无生物膜的中性污水中均保持良好的稳定性，但酸性条件下不稳定[36]. 有研究表明，使用氨人口标准化估计尼古丁消费量，与污水处理厂服务人口数量估计具有较高的一致性. 此外，由于DNA在环境中的稳定性，利用DNA特异性传感器进行实时定量的研究展现出较好的应用前景. 也有学者认为多参数模型不仅综合各参数优点，同时避免单参数波动大的缺点，能够兼顾稳定性和变化性[37 − 38].
BRIEN等[39]提出，人口标志物的最佳选择准则，即易于测量（含量高于定量限），人均负荷量与人口相关性强（R2>0.8），降解率可忽略（污水中24 h损失<10%）. THAI等[40]利用分析人口普查期间污水样本，对可待因、美沙酮等的校正因子进行修订，BRIEN等[41]则提出，通过对人口普查期间所收集污水样本中化学物质进行筛选，可能确定以前未被视为潜在人口标志物的内源性或外源性物质. 结合药物流行病学，并通过贝叶斯定理将多种、无偏差人口标志物融合到单一模型中，可以提供人口估算的不确定度，因此被认为是很有应用潜力的.
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一般而言，校正因子是通过利用代谢目标物的代谢比例计算而来. 研究对象和研究方法的差异，使得不同研究中MAMP的校正因子差异明显（2.3—4.4）. Zuccato等最早采用最常见吸食方式排泄率的平均值（43%）计算校正因子为2.3. Lai等基于口服、烫吸、鼻吸和注射的代谢计算平均排泄率为33%. GRACIA-LOR等[2]按照不同给药途径后人类排泄比例的文献数据，通过受试者数量加权计算平均排泄比例为39%. 所调研文献中，多数按照43%的排泄率计算校正因子（图6B）.
当前，MAMP校正因子的研究存在以下问题：1、MAMP合成路线多种多样，所制备的产品中不同活性手性分子的比例在变化；2、当前文献报道关于尿液代谢的药理学研究较少，且大多数较早，只涉及少量受试者；3、研究中覆盖的剂量范围小，往往低于吸毒者常用剂量；4、尿液排泄研究大多数为西方国家开展，没有考虑不同种族的排泄差异；5、大多数研究中的受试者全为男性，而未考虑实际性别差异；6、较小的尿液排泄比例可能提高研究结果的不确定性. 7、其他物质的摄入可能会影响药物代谢特征. 8、关于粪便等排泄物中代谢目标物的研究较少.
由于工作实际，并不能开展真实性验证. 为此，可以选择其他替代方案. 一是使用亚细胞人肝微粒体，重组DNA表达酶，进行体外研究. 这种技术已经被用于鉴定和阐明几种新精神活性物质的代谢物，成为传统药代动力学研究的重要替代方案[42,43]. 二是使用特定的模拟软件，如Meteor SMARTCyp能够预测给定化合物的代谢并对可能的不同代谢物进行排序[8,44 − 45]. 这两种选择的主要局限性是它们提供有关药物代谢的定性信息，但没有关于尿液排泄速率的数据.
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苯丙胺等手性分子在污水流行病学的回溯计算中存在特殊的问题. 手性分子具有相似的物理化学性质，但生物学性质可能不同，其来源合法性也不同. 代谢和排泄情况与母体的对映体形式有关，但通常利用污水流行病学的毒情回溯推断中并不区分其对映体形式，因此可能造成消耗估计偏差.
CASTRIGNANO等[46]按照以下公式计算异构体比例. EF=S（+）/S（＋）+R（-）. 如采用常见的Leuckart法制造MAMP时产物为外消旋，EF=0.5. 由于代谢后，药物的对映体分布保持不变，主要滥用异构体S（+）MAMP的代谢只会产生S（+）MAMP和S（+）苯丙胺. 同时，吸食S（+）MAMP后，约有40%的MAMP和4%—7%的苯丙胺被排出体外（图3A），则对应的AMP/MAMP比例为0.1—0.175. 因此，通过研究异构体比例和AMP/MAMP比例可研判污水样品是否存疑或者毒品可能存在其他来源，如制造毒品、直接投放等，还可以研判制毒路线. 此外，据报告，MAMP消费剂量越高，AMP/MAMP比值越低（<0.1）. 因此，GAO等[47]根据中国污水中AMP/MAMP比值（0.055—0.070）远低于澳大利亚（0.18±0.05），认为中国的MAMP消费剂量要高于澳大利亚.
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污水流行病学已经在世界范围内得到广泛应用，并证明了其在量化不同时间和空间范围内毒品滥用中的巨大潜力. 但在污水采样、检验分析等操作过程，生物标志物稳定性等理化特性，以及理论公式中各参数的选择应用等方面还存在一些不确定度，从而造成结果与真值的偏差. 因此，迫切需要完成以下工作. 一、通过蒙特卡洛等模拟对不确定度进行评估，在进一步研究分析的基础上尽量降低不确定度. 二、完善统一标准，增加研究结果的可比性和可信度.
除不确定度外，污水流行病学还存在一些其他问题，包括无法提供关于吸毒流行率和频率、毒品纯度以及主要吸毒者年龄范围的信息. 某些药物的合法利用对代谢目标物浓度和分析目标物滥用量的影响无法准确估算. 例如，吗啡是临床上常用的麻醉剂，但从事基于污水流行病学毒情监测工作的相关人员并不掌握监测阶段的吗啡用量，同时吗啡作为海洛因的代谢产物，使得吗啡和海洛因的滥用量估算往往存在偏差. 可开发污水分析与药物流行病学相结合的方法，降低分析目标物合法来源对分析结果的干扰影响.
近年来，新精神活性物质层出不穷，有关犯罪情况显著上升，成为各国打击预防的重点和难点. 利用污水流行病学进行滥用监测存在诸多困难. 一、对首次发现的新精神活性物质缺乏必要的全国性或者全球性监测预警机制. 二、由于新精神活性物质更新迭代快，无法及时掌握其流行度、成瘾性等相关信息. 三、缺乏对其药代动力学、代谢产物稳定性等基础研究，难以估算其消费量. 四、特定物质的使用水平较低，在污水中含量往往比传统毒品更低，增加检验分析难度. 五、标准物质，特别是同位素标准物质的缺乏成为准确定量分析的瓶颈.
污水流行病学在毒情监测中的不确定性-以甲基苯丙胺为例
Uncertainties of illicit drugs consumption estimated by wastewater-based epidemiology: The case of methamphetamine
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摘要: 污水流行病学在毒情监测评估中发挥的作用日趋显著，但在实战应用中仍存在一些亟待研究解决的问题，突出体现为监测结果的不确定性. 本文首次以国内滥用最为严重的甲基苯丙胺为切入点，结合近年来文献中有关参数的采用情况，对采样、仪器分析和计算过程中可能引起毒情评估偏差的因素进行全面比对分析. 同时，指出今后研究的重点方向，以期进一步提高基于污水流行病学的毒情监测工作的标准化和精准度，为相关研究工作提供参考.Abstract: Wastewater-based epidemiology (WBE) plays a vital role in monitoring the pattern of consumption of illicit drugs in a general population. However, it also brings several uncertainties about the results. For the first time, the paper investigates the potential and reliability of WBE methodologies from methamphetamine, the most abused drug in China, by critically looking at the literature published in the last three years. The uncertainties related to sampling methodology, analytical procedure, and consumption calculation are analyzed in detail, and suggestions to further promote WBE studies and universal analysis criteria for valid comparisons are provided.
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Key words:
- wastewater analysis /
- methamphetamine /
- uncertainty /
- anti-drugs.
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图 2 文献报道中采用的采样模式（A）和采样位置（B）
Figure 2. Sampling modes （A） and positions （B） reported in the reviewed journal articles
图 4 文献报道中采用的前处理方法（A）和不同环节相应技术手段使用比例（B）
Figure 4. Pre-treat methods （A） and conditions or technologies （B） used in the reviewed journal articles
图 5 污水中甲基苯丙胺在不同条件下的稳定性研究
Figure 5. Stability of methamphetamine in unfiltered wastewater with no preservation（A）, acid preservation （B） and sodium metabisulfite as a preservative （C） [24]（Dotted line indicates the 20% threshold）
图 6 文献报道中采用的人口估算方法（A）和校正因子（B）
Figure 6. Population estimate methods （A） and correction factors （B） used in the reviewed journal articles
表 1 SCORE制定的最佳实践要求
Table 1. Best practice protocol adopted by SCORE
指标
Index要求
Requirements采样点 污水处理厂进水口 样品类型 24 h 流量等比例后混合 样品容器 PET或玻璃 其他信息 污水厂类型、采样模式、采样位置、流量、BOD、COD、TN、TP、温度、pH 采样条件 <4 ℃ 存储条件 立即冷冻或12 h内分析 内部控制 同位素内标 外部控制 实验室能力验证 
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