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钦汤是由诃子、川楝子、栀子、瞿麦、红花、五灵脂、川木通、人工牛黄8味药材混合制成的蒙药经典处方，主要用于治疗肝胆热，肝肿大，肝区痛。蒙药复方制剂成分复杂，在临床应用中往往是多组分间的协同作用达到治疗效果。目前钦汤质量标准中仅有性状、鉴别和检查项，无含量测定，而单一成分测定不能反映钦汤的整体化学信息，难以控制和评价制剂质量[1]，为更全面地完善其质量标准体系，本研究采用多组分同时测定的方法对多个成分进行质量评价从而对复方制剂实现综合、整体的评价模式。
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Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）、BSA224S-CW 万分之一电子天平（ 北京赛多利斯科学仪器有限公司）、SQP 型十万分之一电子天平( 北京赛多利斯科学仪器有限公司)、超纯水仪 (美国赛默飞世尔科技有限公司)、AS10200 超声波清洗机(40/60 Hz，北京华瑞博远科技发展有限公司)、TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司)。
钦汤（规格：每袋3g，批号 910281、910282、910283，包头市蒙医中医医院院内制剂）；对照品没食子酸（批号110831-201605，含量≥90.8%）、羟基红花黄色素A（批号111637-201810，含量≥93.1%）、栀子苷（批号110749-201919，含量≥97.6%）、鞣花酸（批号111959-201602，含量≥89.3%）购自中国食品药品检定研究院；对照品原儿茶酸（批号AF9062921，含量≥98%）购自于埃法生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯或分析纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、栀子苷、鞣花酸适量，甲醇溶解得各对照品储备液。加80%甲醇制成以下不同质量浓度的没食子酸（39.402、52.536、65.670、78.804、91.938、105.072 µg·mL−1）、原儿茶酸（6.690、8.920、11.150、13.380、15.610、17.840 µg·mL−1）、羟基红花黄色素 A（41.508、55.344、69.180、83.016、96.852、110.688 µg·mL−1）、栀子苷（172.62、230.16、287.7、345.24、402.78、460.32 µg·mL−1）、鞣花酸（34.530、46.040、57.550、69.060、80.570、92.080 µg·mL−1）的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备 精密称定2.0 g钦汤粉末于锥形瓶，加入80%甲醇40 mL，称定质量超声提取40 min，取出放冷，减失的重量用80%甲醇补足。提取液于离心机离心10 min（5000 r·min−1），取上清液，微孔滤膜滤过（0.22 μm），收集续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备 根据钦汤处方比例制备缺诃子、红花、栀子的阴性样品.
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色谱柱采用Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱，见表1；流速：1.0 mL·min−1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；254 nm（0—12 min，检测没食子酸、原儿茶酸）、403 nm（12—17 min，检测羟基红花黄色素 A）、238 nm（17—20 min，检测栀子苷）、254 nm（20—45 min，检测鞣花酸），进样前用甲醇溶液冲洗色谱柱10 min，再用流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）平衡8 min。该色谱条件下各峰峰型良好，分离度均大于1.5。
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精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 µL注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测，记录色谱图。结果表明，在该色谱条件下，5个成分明显被准确分离（R＞1.5），理论塔板数大于3000，阴性溶液对5个待测组分无干扰，表明该方法专属性好。
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不同质量浓度的混合对照品溶液按上述色谱条件进样测定，以溶液浓度为横坐标（X，µg·mL−1），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。得到5个组分的回归方程及线性范围，结果显示没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素 A、栀子苷、鞣花酸均保持良好的线性关系，结果见表2。
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同一混合对照品溶液，按上述色谱条件进样 6次，测得5个组分的峰面积RSD分别为 0.30%、0.38%、0.37%、0.33%、0.78%，RSD＜2%，表明仪器精密度良好。
精密称定钦汤粉末2.0 g（批号910281），按上述方法制备供试品溶液，分别于 0、3、6、9、12、24 h进样检测，记录峰面积。5个成分的峰面积RSD分别为0.68%、0.63%、0.46%、0.30%、1.17%，表明供试品溶液在24 h内保持良好的稳定性。
精密称取同一批次钦汤样品2.0 g（批号910281），按上述方法制备6份供试品溶液，根据上述色谱条件进样检测，记录峰面积。按照回归方程计算5个成分的含量，没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素 A、栀子苷、鞣花酸分别为1.0629、0.0875、1.172 2、6.8014、1.2776 mg·g −1，RSD值分别为 0.37%、2.35%、0.88%、0.93%、0.46%，RSD值均在规定值范围内，结果表明该方法重复性良好。
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取已知含量的钦汤粉末9份（批号910281），每份约1.0 g，精密称定，分为3组，每组3份。每份精密加入适量对照品溶液，相当于标示量的50%、100%、150%，用80%甲醇溶液定容至40 mL，摇匀。按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样检测。计算5个成分的平均加样回收率，测得没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、栀子苷、鞣花酸的平均加样回收率分别为100.9%、98.8%．101.4%、101.8%、100.7%，RSD 分别为 0.57%、1.07%、0.95%、0.39%，0.64%，均＜2.0%。
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取3个不同批次的钦汤样品（910281、910282、910283），每个批次3份，共9份。制备供试品溶液，根据上述色谱条件进样检测，记录各组分峰面积，按外标法计算5个成分的含量，结果见表3。
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本实验采用HPLC波长切换法同时完成了钦汤中5种活性成分的含量测定，该方法简便、快捷，测定结果准确度高、重复性好，可用于钦汤质量的控制。该方法的建立为钦汤质量标准的提升提供了数据支持。
HPLC波长切换法同时测定蒙药钦汤中5种活性成分的含量
Simultaneous determination of five active components of Qintang through wavelength conversion by HPLC
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摘要: 本文建立HPLC波长切换法同时测定蒙药钦汤中没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、栀子苷和鞣花酸的含量的方法。试验结果表明，测定的没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、栀子苷、鞣花酸分别在检测范围内（0.358—0.954 µg、0.066—0.175 µg、0.386—1.031 µg、1.685—4.493 µg、0.308—0.822 µg）保持良好的线性关系；平均加样回收率为98.8%—101.8%，RSD＜2.0%；3批样品中5个成分的含量分别是1.0399—1.0629、0.0778—0.0863、1.0986—1.1844、6.5152—6.836 3、1.2444—1.3098 mg·g −1。该方法简便、准确，可同时测定钦汤中5种活性成分，适用于钦汤质量的控制。Abstract: An analytical method for determining gallic acid, protocatechuic acid, hydroxysafflor yellow A, gardenoside and ellagic acid in Qintang of Mongolian medicine was established by high performance liquid chromatography（HPLC）wavelength switching. The results showed that the five components of gallic acid, protocatechuic acid, hydroxyl safflower yellow A, gardenoside and ellagic acid were maintain a good linear relationship within the detection range (0.358—0.954 µg、0.066—0.175 µg、0.386—1.031 µg、1.685—4.493 µg、0.308—0.822 µg) . The average recoveries were 98.8%—101.8%, RSD < 2.0%. The contents of 5 components in 3 batches of samples were 1.0399—1.0629, 0.0778—0.0863, 1.0986—1.1844, 6.5152—6.8363, 1.2444—1.3098 mg·g−1, respectively. The method is simple, accurate, and can simultaneously determine five active ingredients in Qintang, and is suitable for the quality control of Qintang.
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Key words:
- Qintang /
- gallic acid /
- protocatechuic acid /
- hydroxysafflor yellow A /
- gardenoside /
- ellagic acid /
- HPLC /
- wavelength switching method
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表 1 梯度洗脱表
Table 1. Gradient elution
洗脱时间/min 0—6 6—10 10—16 16—22 22—25 25—32 32—38 45 流动相（A）/% 9—9 9—13 13—15 15—18 18—18 18—28 28—48 48 
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表 2 5种成分的回归方程及线性关系
Table 2. The regression equations linear ranges of five components
成分 回归方程 r 线性范围/µg 没食子酸（gallic acid） Y=0.309 1X+0.187 7 0.999 9 0.358—0.954 原儿茶酸（protocatechuic acid） Y=0.557 8X+0.021 7 0.999 9 0.066—0.175 羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A） Y=0.514 2X+0.106 5 0.999 9 0.386—1.031 栀子苷（gardenoside） Y=0.257 2X+0.444 9 0.999 9 1.685—4.493 鞣花酸（ellagic acid） Y=1.420 1X-0.472 1 0.999 9 0.308—0.822
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表 3 钦汤样品含量测定结果（mg·g-1，n=3）
Table 3. The results of sample content determination of Qintang
批号 没食子酸 原儿茶酸 羟基红花黄色素 A 栀子苷 鞣花酸 910281 1.047 1 0.077 8 1.098 6 6.515 2 1.244 4 910282 1.039 9 0.081 4 1.136 5 6.642 6 1.287 3 910283 1.062 9 0.086 3 1.184 4 6.836 3 1.309 8
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[1] 冯建安, 施崇精, 李希, 等. HPLC法同时测定济川合剂中7个药效成分 [J]. 药物分析杂志, 2020, 40(8): 1349-1354. FENG J A, SHI C J, LI X, et al. Simultaneous determination of seven effective constituents in Jichuan mixture by HPLC [J]. Chin J Pharm Anal, 2020, 40(8): 1349-1354(in Chinese).
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