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近年来，随着人们生活质量的不断提高，对市场上水产品需求量日益增加，因此池塘高密度养殖方式应运而生. 相较于传统的养殖方法，高密度养殖会产生大量的粪便以及残饵，这些污染物排入水体中会导致养殖尾水的污染不断加剧. 为响应当前环保工作的推进，各地农业及生态环境部门相继提出池塘生态化改造政策，力求通过池塘标准化改造提升养殖尾水治理成效，加快渔业绿色发展，促进乡镇振兴. 因此养殖尾水的处理已经成为影响我国养殖行业发展的重要因素.
目前国内针对农村养殖尾水处理的技术各不相同，根据净化原理主要分为生物、生态和生物生态组合工艺[1]等. 近年来，潜流湿地处理养殖尾水日益受到关注[2]. 垂直潜流湿地是一种模拟天然湿地并利用基质、植物、微生物的物理、化学、生物等多重协同作用降解污水中污染物的方法[3-4]. 用来处理养殖尾水具有投资少、处理效率高、易维护等优点. 国内外对于垂直潜流湿地的研究主要基于改造湿地填料基质、水生植物选配[5-7]，多孔填料的粒径、比表面积越大，水生植物的种类搭配越丰富，污染物去除效率越高[8-9]. 在由基质、水生植物和微生物组合的垂直潜流湿地系统中，微生物对养殖尾水中氮、磷的去除起着重要作用[10].
本研究通过构建菌剂强化-多级生物填料潜流湿地养殖尾水试验系统，采用生物镜检、高通量测序等手段，对系统内微生物种群结构、丰度、优势菌群进行分析，破解蟹池养殖尾水湿地净化过程中的微生物种群变迁，为潜流湿地净化蟹池养殖设施的应用提供理论依据与工程设计参考.
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装置启动与挂膜。试验定在夏季7—9月份，此时河蟹正值黄蟹期，水中总氮（TN）、总磷（TP）、COD以及叶绿素a（Chla）含量较高. 试验运行期为50 d，以15 d为1个试验周期，共分为3个周期，装置稳定运行5 d后进行水质参数的测定. 预先将生物膜放入复合菌发酵液进行挂膜培养和驯化（室温20±5 ℃、自然光照）后固定在装置内的底泥中，定期在水箱中补充蟹池尾水维持装置尾水自流状态，各周期末对装置内的微生物数量及种类进行测量并计数.
试验装置如图1所示，垂直潜流湿地试验组整体选用PP板，装置L×B×H=1 m×0.4 m×0.5 m. 该部分主要由集水区、湿地处理区和出水区三大部分所构成. 其中集水区主要填充火山石滤料（10—20 mm） [11]，湿地处理区填料基质自下而上分别由砾石（40—50 mm）、红砖碎块（15—35 mm）、陶粒（4—8 mm），生物膜（仿水草式生物填料），湿地的孔隙率为45.1 %，净化尾水通过中间隔板上部7个并排直径为6 cm的小孔流入出水区. 装置中水生植物及底泥取自中国江苏省常州市武进区前黄镇杨家圩蟹池示范工程现场，水生植物先用去离子水浸泡10 min后再移入装置. 对照组设定为同上述试验组装置，但不投加菌剂. 火山石对照组设定为装置仅有集水区-火山石滤料，并不投加菌剂.
生物膜：仿水草式水处理填料购自益生环保科技股份有限公司，该填料模拟天然水草形态，加之其本身的特殊组织，可使填料挂膜后依然为漂浮状态达到修复净化水质作用.
复合菌剂：选用本课题组前期筛得反硝化聚磷菌B8（恶臭假单胞菌，保藏号CGMCC NO.9168）与溶藻、脱氮除磷双效工程菌XMC（芽孢杆菌）等比例混合而成.
水生植物：选用多年生的睡莲，具备食用价值、药用价值和环境修复价值. 本课题组前期研究发现睡莲15 d内对蟹池尾水的TN、TP、CODMn去除率分别达到94.3%、98.9%、81.2%.
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进水水质：对应黄蟹期排水水质的变化，设定装置在运行50 d内的水力负荷为0.065 m3·（m2·d）−1，试验水质以蟹池尾水为进水水质，如表1所示.
水质参数测定方法：参照国家环保总局发布的《水、废水检测与分析方法(第四版)》，采用过硫酸钾氧化法测定TN，过硫酸钾消解法测定TP，酸性高锰酸钾氧化法测定CODMn. 采用哈希便携式水质检测仪现场测定pH值、T（温度）和溶解氧（DO）.
溶藻计算方式: 利用乙醇法测定Chla含量[12]并计算，Chla（式1）以及溶藻率（式2）测定公式如下:
式（1）中，V2表示提取液体积（mL），即90%乙醇的体积，8 mL；D表示吸光度；V1表示藻液体积（L）；δ比色皿光程，1 cm.
浮游藻类计数前处理[13]: 取0.5 L水样，滴加鲁哥氏液静置过夜.在常压下用虹吸管吸取上层液体对水样进行浓缩，浓缩倍数为V（环境水样）/V（实测水样）.
浮游藻类数量及种类计数方法：取浓缩样品0.1 mL注入计数架（20 mm×20 mm），在显微镜（10×40或8×40）下观察100个视野. 利用浮游生物智能识别计数器（PIIC，中国杭州万深检测技术有限公司）中的藻类图谱进行比对，并参考《中国常见淡水浮游植物图集》对浮游藻类的种类进行鉴定和计数.
生物膜中附着微生物的镜检方法：取适量的生物膜切片放入离心管（5 mL）中，加入超纯水定容并离心（800 r·min−1）后取样置于显微镜下观察. 通过比较浮游生物智能识别计数器中的微型动物图谱，并参考《淡水微生物区系》对微型动物的种类进行鉴定和计数.
细菌种类及数量计数方法：从装置内底泥中取完土样后，加入灭菌石英砂及少量液氮，充分研磨后按照PowerSoil试剂盒提供的方法，进行DNA的提取，最后由上海天昊生物科技有限公司完成微生物高通量的测定及PCR的扩增.
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当富含氮、磷的污染物排入水体并超过了水体自身承受负荷时，会导致水质恶化，造成水体富营养化等环境现象。可通过3种主要的途径进行去除，湿地系统中基质的物理化学作用、微生物的同化作用和植物根系的摄取共同完成[14].
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如图2(a)所示，复合菌(XMC、B8菌)的引入对装置的脱氮率有较为显著的提升（P＜0.05）. 运行初期（6—21 d）投菌组的出水平均浓度为（2.04±0.11） mg·L−1，相比对照组降低了（2.25 ±0.08） mg·L−1，投菌组平均脱氮率为86.29%±2.77%，比对照组增加了近22.65%±0.71%，水温在33 ℃的几天里，投菌组的总氮降解率最高可达95%±0.22%.
由图2（b）可知，试验初期（6—21 d）湿地主体与火山石滤料层对系统脱氮的贡献相同，但随着湿地内水生植物的作用及微生物种群的增多，投菌组中湿地贡献所占比重逐步高于火山石滤料层. 随着装置运行的延续，陶粒、沸石等填料表面附着的生物膜种群的增加，投菌组在没有外加菌源的补充下，各种群对于碳源、氧气的竞争不断增强[15]，进而导致整个湿地系统脱氮效率会逐步降低， 对照组生物量逐渐增加，最终两套装置运行末期脱氮率趋于一致.
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由图3（a）所示，复合菌（XMC、B8菌）的引入对装置的除磷率有较为显著的提升（P＜0.05）. 运行初期（6—21 d）投菌组的出水浓度为（0.33±0.08）mg·L−1，相比同时期对照组降低了（0.22±0.07） mg·L−1，投菌组的总磷平均去除率为91.19%±1.18%，比对照组的去除率高出5.99%±0.87%.
由图3（b）可知，投菌组除磷率高于对照组，且湿地系统除磷率占比更大，其主要表现在：随着生物膜分布愈发密集，通过微生物的同化作用[16]，可以加大对总磷的去除效果，同时附着在生物膜上的浮游藻类可拦截并吸收一部分有机大分子，生物膜本身比表面积相对较大，也可对系统中部分遗漏的磷酸盐小分子进行拦截，保证总磷的去除效果. 装置运行后期，两组总磷的出水浓度趋于接近，可能是随着装置的运行，湿地内部填料层出现常见的堵塞问题，从而降低湿地内部DO含量，导致反硝化聚磷菌厌氧易释磷，进而出现了装置出水总磷浓度不减反增的局面. 此外也可能在好氧情况下聚磷菌大量吸收磷酸盐，形成多聚物高磷污泥，但聚磷菌残体不能被排出湿地系统，导致磷又重新释放进入湿地系统. 因此需定期（每年）更新火山石滤料以保持稳定净化能力[17].
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从图4（a）可看出，潜流湿地系统对CODMn的处理效果总体较为稳定，投菌组由于复合菌的引入，在生物挂膜的过程中对微生物群落的构成起到一定的影响，导致在装置运行前期投菌组的CODMn去除率有显著提升（P＜0.05）. 试验运行至中后期，随着气温的增长，水中DO的变化，装置内生物量的增多，投加菌剂的作用相对降低（P＞0.05），平均出水浓度达到（34.39±2.65） mg·L−1，平均去除率维持在70.88%±3.10%.
从图4（b）可看出，复合菌剂的投入可以在短期内显著提高装置的叶绿素a去除能力（P＜0.05），总体而言试验期间两组装置对叶绿素a的去除率趋向一致，潜流湿地对叶绿素a的平均出水浓度为（2.38±1.03） mg·L−1，平均去除率达到90.95%±1.64%，从中可看出湿地系统本身具备良好的叶绿素a的降解效能. 湿地中叶绿素a的去除方式主要以湿地填料的物理吸附为主，菌株的溶藻特性为辅. 试验运行过程中，水力停留时间较长，生物膜上的微生物有较充分的时间进行“溶藻”及“噬藻”，最终沉淀于底泥层.
综上可知，湿地整体对各污染物的降解能力以填料的物理吸附为主，菌剂为辅.其中火山石滤料为主的滤石层有显著的氮、磷吸附能力，但需定期更换滤料以保持净化效果. 本课题组研发的复合菌剂对湿地中TN、TP、CODMn和Chla均有不错的去除效果，可迅速改善水质. 在实际的工程应用中，可适当增加睡莲、矮苦草、黄菖蒲等水生植物来进一步提高系统整体净化效率，在适宜的气候和合理的植物搭配下，水生植物可以通过其强大的根系去吸收水中的无机氮、磷，进而转化并储存于自身机体组织内，若能做到及时收割植物的地上部分，将会提高湿地系统整体去除效率，但各类植物在湿地系统中如何做到长期应用，还有待于进一步观察.
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生物膜上附着生长的藻类、原生动物、后生动物、细菌和真菌等微生物的种类和数量可以反映污水水质，起到指标生物的作用，其中底泥是微生物净化水体中含氮污染物的重要场所.
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装置中藻类分布主要以依附在生物填料上的浮游藻类为主，它们通过吸收分解产物一些简单的无机营养物质，进而加速生长繁殖.同时通过吸收水体中的氮、磷进行光合作用为填料上的生物膜提供氧气，以便于附着其上的微生物对水中污染物进行有效分解.
如表2所示，通过生物镜检发现，湿地内藻类主要分布在硅藻门、绿藻门、蓝藻门、裸藻门中，随着浮游藻类种群类别的日趋多样性变化，其对水质的净化吸收越有利[18-19]，推测原因是睡莲通过根系分泌化感物质[20]，溶藻菌通过直接与间接的溶藻方式，破坏藻细胞中的叶绿素a，进而抑制超氧化物歧化酶的活性，达到抑制营养化类藻类的生长. 部分典型的藻类镜检如图5所示.
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微型动物在尾水处理中起着重要作用，一方面它们可以直接分解和代谢尾水中的可溶性有机物，另一方面能参与细菌、藻类或有机小颗粒和碎片的吞噬作用，此外还可以促进菌胶团絮凝. 表3显示了生物膜上检测到的微型动物前后变化，系统中指示生物的变化可佐证水质得到有效改善. 结果表明湿地系统水质改善后伴随有大量微型动物出现，其中以纤毛虫纲为主[21]，表明水体中含氧量适宜，系统水质相对稳定，轮虫的存在可说明系统的处理效率较高[22].
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装置运行15 d后，对照组/试验组检测出的细菌分属107/99个目（Order）、180/172个科（Family）、352/317个属（Genus）. 其中XMC菌（Bacillus）属于芽孢杆菌纲-芽孢杆菌目-芽孢杆菌科，B8菌（Pseudomonas）属于变形菌纲-假单胞菌目-假单胞菌科.
底泥中微生物群落结构在科水平的组成分布如图6a所示，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）水平占比增量可达21.22%，其中本试验投放工程菌—芽孢杆菌科（Bacillus）、假单胞菌科（Pseudomonas）的占比分别由0.88%提升至1.43%、由1.68%提升至5.37%，说明工程菌在该湿地体系中活跃度增加. 微生物群落结构在属水平组成分布如图6b所示，在属类水平上，菌属呈现出丰富的多样性. 其中工程菌芽孢杆菌属（Bacillus）的占比由1.06%提升至2.11%；工程菌假单胞菌属（Pseudomonas）在土壤中占比由1.57%提升至5.21%.由上述数据增长来看， 垂直潜流湿地中养分含量、粒径分布、植物根系等大大促进了投加的工程菌增殖，说明复合菌剂在潜流湿地模拟装置中能够生存并形成稳定生物膜，用于处理富营养化水体[23].
综上可知，随着湿地系统运行的延续，浮游藻类、微型动物和细菌附着在生物膜载体上，这些生物膜能形成一个天然的“生物格栅”，可有效的拦截水中的有机大分子及一些悬浮物. 随着生物膜内外层DO的梯度变化，这层生物膜相当于许多小型”A/O”反应器，从而使得污染物得到有效的降解.随着微生物种群的不断丰富，从而通过微生物的同化作用加快对污染物的去除.
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（1）垂直潜流湿地系统对蟹池尾水中TN、TP、CODMn和Chla均有较好的降解能力，平均降解率分别达到86.29%±2.77%、91.19%±1.18%、70.88%±3.10%、90.95%±1.64%，系统净化后养殖尾水可实现达标排放.
（2）潜流湿地的净化主要以填料的物理吸附为主，菌剂为辅，火山石滤料层对系统中氮、磷的净化做出了极大贡献，但需定期更换滤料以保持持续净化效果，复合菌剂的投入可在短期内提升系统的净化能力，随着生物膜上微生物的富集，菌剂的净化能力逐步降低.
（3）由生物镜检可知，随着潜流湿地运行的延续，系统中指示生物的变化可佐证水质得到有效改善，微生物的数量和种类逐渐增多表明改善后的水质更利于微生物的生长.
垂直潜流湿地净化蟹池养殖尾水试验
Experiment on purification of crab pond aquaculture tailwater by vertical-flow constructed submerged wetland
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摘要: 用垂直潜流湿地系统打造闭环式生态养殖模式可达到蟹池尾水零排放.本文以蟹池养殖尾水为受试对象，通过建立“滤石层-载体生物膜”复合型生态系统，考察了河蟹黄蟹期内养殖尾水中氮、磷等污染物的去除特性，调查了垂直湿地模拟装置内生物相特征。结果表明，潜流湿地系统主要通过物理吸附和生物降解的方式对养殖尾水中的污染物进行降解，总氮、总磷、COD和叶绿素a的平均去除率分别为86.29%±2.77%、91.19%±1.18%、70.88%±3.10%、90.95%±1.64%，火山石滤料层表现出显著的氮、磷去除能力, 复合菌剂的运用可迅速提升系统整体净化能力. 生物相分析揭示，随着潜流湿地装置运行延续，系统内浮游藻类、微型动物、细菌的数量及种类呈不断增长趋势, 指示类微生物的出现表明系统内水质得到改善，证明净化后的水质更适于多种类微生物的生存与繁殖，最终实现养殖尾水零排放.Abstract: A closed-loop ecological system can accomplish no tailwater discharge from crab ponds with the help of a vertical submerged wetland system. In this paper, the tailwater is used as experimental target, a composite ecosystem of "stone layer- carrier biofilm" is established. The removal characteristics of pollutants, nitrogen and phosphorus, in the tailwater of river-crab during the breeding period of crab are examined, and the characteristics of biological phases in the vertical wetland simulator are investigated. The results showed that the submerged wetland system degraded the pollutants in the cultured tailwater by physical adsorption and biodegradation. The average removal rates of total nitrogen, total phosphorus, COD, and chlorophyll-a were 86.29%±2.77%, 91.19%±1.18%, 70.88%±3.10%, and 90.95%±1.64%, respectively. Nitrogen and phosphorus can be removed at the volcanic stone filter layer. The introduction of the composite bacterial agent can effectively improve the whole purification capacity of the system. Biological phase analysis reveals that the number and kinds of planktonic algae, microfauna, and bacteria in the system keep increasing with the continuously running of the submerged wetland. The appearance of indicator microorganisms indicates that the water quality in the system has been improved, which suggests the purified water is more suitable for the survival and reproduction of different kinds of microorganisms.No aquaculture tailwater discharge can be achieved.
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图 6 微生物群落结构组成分布
Figure 6. Composition and distribution of microbial community structure
表 1 试验进水水质
Table 1. Test water quality
水质指标
Water quality indexpH T/℃ TN/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) CODMn/(mg·L−1) 数值范围
Numerical value7.20—7.45 31.5—32.3 4.126—4.325 0.196—0.215 43.8—45.1 
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表 2 各试验周期内浮游藻类种群变化
Table 2. Changes of plankton algae population in each test cycle
门类
Gate level属类
Genus试验周期
Experimental cycle初期
Initial stage中期
Middle stage末期
Last stage硅藻门
Bacillariophyta辐节藻属
Stauroneis+ + + 舟形藻属
Navicula+ + 菱形藻属
Nitzschia+ + 桥弯藻属
Cymbella+ 盒形藻属
Biddulphia+ 绿藻门
Chlorophyta小球藻属
Chlorella+ + + 新月藻属
Closterium+ + 角星鼓藻属
Staurastrum+ + 裂鼓藻属
Euastrum+ 鼓藻属
Cosmarium+ 衣藻属
Chlamydomonas+ 蓝藻门
Cyanophyta须藻属
Homoeothrix+ + + 色球藻属
Chroococcus+ + 微囊藻属
Microcystis+ + 裸藻门
Euglenophyta扁裸藻属
Phacus+ + + 囊裸藻属
Trachelomonas+ + 鳞孔藻属
Lepocinclis+ + 藻类数量
Algae quantity5 13 15 水质类型
Water quality type** ** * * 注: 水质类型判断指标依据湖泊富营养化的藻类生物学评价及污染指示种[17], “+”: 表示该藻类在系统中检出; “**”代表富营养型水质, “*”代表中营养性水质. Note: the judgment index of water quality type is based on the biological evaluation of lake eutrophication and pollution indicator species[17], “+”: indicates that the algae is detected in the system; “**” represents eutrophic water quality, “*” represents medium nutrient water quality.
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表 3 生物膜上微型动物的变化
Table 3. Changes of microfauna on biofilm
名称
Definition初期
Initial stage中期
Middle stage末期
Last stage微型动物
Miniature animals纤毛虫纲
Ciliates漫游虫属
Litonotus+ + + 豆形虫属
Colpidium+ 草履虫
Paramecium+ 尾毛虫属
Urotricha+ 鞭毛虫纲
Mastigophora二态虫属
Dimorpha+ + + 四鞭虫
Trepomonas+ + 肉足虫纲
Sarcodina名壳虫
Pamphagus+ + 轮虫Rotifera + + + 注: “+”表示系统中镜检出该属微型动物.
Note: “+” indicates that the micro animal is detected by microscope in the system.
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