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2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）是一种广泛用于有机合成的酚类化合物，在农业、工业和医药等方面的应用日益广泛[1]. 由于储存和使用不善，2,4-DCP会通过农药、废水、泄漏等途径排放到环境中[2]. 据报道，在我国很多流域中均有2,4-DCP的检出，最高可达1 mg∙L−1[3 − 4]. 2,4-DCP能使蛋白质变性，对人体内分泌、神经和免疫系统造成永久性伤害，具有“三致”效应[5]. 已有较多文献报道了2,4-DCP对水生动物的毒性效应：Tsukazawa等[6]研究表明，斑马鱼幼鱼暴露于2,4-DCP浓度为2.5 mg∙L−1的水体中5 d时，可观察到脂质积累和ROS诱导；Hu等[7]发现，2,4-DCP可通过干扰性激素合成来诱导鱼类雌性化. 然而，目前对2,4-DCP的毒性评估在土壤生物方面研究尚少. 因此，开展2,4-DCP对土壤生物毒性研究，有助于更全面的评估其生态风险.
蚯蚓和微生物群落常用于毒理学研究，它们的生物量占据土壤生物的绝大部分，与土壤功能息息相关[8]. 蚯蚓经常作为评价土壤环境的指示生物，其表现出的毒性效应对土壤污染物的早期预警和生态危险评估具有重要意义[9]. 而微生物作为维持土壤生产力的重要组分，其多样性变化可在预测环境质量变化、评价土壤生态功能中发挥巨大作用[10]. 此外，蚯蚓作为土壤中最大的无脊椎动物，与微生物之间的关系作用密切，其通过活动以改变微生物群落结构和数量[11]. 已有研究表明蚯蚓可参与污染物的降解与转化，且其活动、分泌粘液和排泄等行为所产生的微生物在此过程中至关重要[12]. 因此，蚯蚓活动以及土壤微生物群落的改变也可能成为土壤中污染物降解的重要因素.
基于以上背景，本研究以赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）作为受试生物，通过分析其致死浓度、抗氧化系统、病理学和行为特征变化来阐明2,4-DCP对蚯蚓的毒性；基于土壤中2,4-DCP的降解规律，采用高通量测序分析2,4-DCP、蚯蚓活动和蚓粪因素下土壤微生物群落变化. 为准确评估2,4-DCP对土壤环境的生态风险提供科学依据.
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试验蚯蚓为赤子爱胜蚓（Eisenia fetida），购自河北石家庄蚯蚓养殖场，于光照培养箱（温度（23 ± 2） ℃，空气湿度70％，光暗比12 h∶12 h，光照强度500 lx）条件预驯养14 d. 挑选色泽红润，活力强，月龄2个月以上，生殖环明显，体重0.3—0.4 g的蚯蚓用于试验.
2,4-DCP（CAS120-83-2，GC纯度99.5％）购自润友化学有限公司. 试验所用丙酮等试剂均为分析纯.
试验土壤采集于常州市滨江化工园区无污染的林地，去除石子树枝等杂物后自然风干，过10目筛备用. 经测定，该土壤pH为7.52 ± 0.17，有机质含量（17.69 ± 1.08）g∙kg−1，且未检出2,4-DCP.
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蚯蚓清肠：将蚯蚓放于培养皿中，清水洗去表皮泥土及排泄物，纱布擦干多余水分. 随后将蚯蚓置于经蒸馏水打湿的滤纸上，黑暗环境下清肠1 d.
粪便采集：蚯蚓经放置清肠1 d后，于无菌条件下，使用灭菌后镊子夹取附于蚯蚓表面及滤纸上的排泄物，放于4 mL塑料管中.
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毒性试验：参考（OECD NO.222, 2016）法[13]进行自然土壤染毒，配置12.5 g∙L−1的2,4-DCP丙酮溶液，于若干斜高7.5 cm，上下直径12 cm、8 cm的PP带盖塑料盒中，均放入风干后的备用土壤500 g，再分别添加2,4-DCP丙酮溶液以制备如图1所示11个梯度2,4-DCP污染土壤. 待丙酮挥发后，加蒸馏水控制土壤含水率为35％，据OECD法所述要求投放10条清肠后大小相似的蚯蚓于土壤表面，将盖子中心掏空后盖上盖子以保持通风，均放于1.1所述条件光照培养箱中，每天以衡重法控制含水率，每组试验3个平行，于第7天和第14天观察各浓度下存活蚯蚓数目.
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于3 d、7 d和14 d时取暴露于以上2,4-DCP亚致死浓度污染土壤中所有蚯蚓（10条，无死亡）清肠后进行超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）测定. 测试前，经蒸馏水清洗蚯蚓表面. 加入蚯蚓质量9倍体积的0.86%NaCl溶液，于4 ℃下搅碎. 然后将匀浆液以4000 r·min−1离心10 min. 取上清液测定SOD活性、CAT活性和MDA含量，均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定，具体测定方法详见试剂盒使用方法.
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根据试验过程中所观察的蚯蚓形态学变化，采用苏木精-伊红染色（HE染色）制备蚯蚓组织切片以观察0、15和25 mg∙kg−1浓度下暴露14 d时蚯蚓表皮和肠道细胞变化. 将清肠后的蚯蚓用生理盐水冲洗后，放于干净培养皿中，加入少量蒸馏水，滴入无水乙醇麻痹蚯蚓后，将蚯蚓拉直放于滤纸上，吸干表面水分后用刀片于生殖环后1 cm处切取0.5 cm放于10%福尔马林溶液中固定24 h. 在自动脱水机中脱水后，石蜡包埋，切片机切成5 µm左右切片，在200倍数光学显微镜（AxioVert.A1）下观察组织变化情况.
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为探明土壤中2,4-DCP对蚯蚓行为特征的影响，本试验通过趋避试验和分布试验以判断不同浓度2,4-DCP暴露对蚯蚓的行为特征影响，试验均在蚯蚓不发生死亡条件下进行.
趋避试验：参考（ISO 17512-1, 2008）[14]，于上述塑料盒中间放一隔板，两侧分别放入清洁土壤和不同浓度染毒土壤各250 g，控制含水率后抽出隔板并投10条蚯蚓于原隔板处缝隙中，48 h后计算两侧的蚯蚓个数，处于原先隔板处的蚯蚓按半条计算. 回避率由式（1）计算[15]：
式中，NR为回避率，N为投加蚯蚓数，C为清洁土壤中蚯蚓数，T为污染土壤中蚯蚓数.
分布试验：对上述试验做了改进，以探讨竖直方向蚯蚓分布情况，取500 g备用土壤放于1.2.2节所述塑料盒中（此时盒中土壤高度为（6.08 ± 0.09） cm），按照1.2.2节的步骤进行亚致死浓度染毒后，投放10条蚯蚓于土壤表面，于7 d和14 d时观察土壤表层和底层3 cm高度范围内蚯蚓的分布.
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降解试验：考虑到蚯蚓的耐受性，配置2,4-DCP浓度为20 mg∙kg−1（最大亚致死浓度）的400 g污染土壤. 用蒸馏水控制土壤含水率为35％，投放总质量为8 g（前期试验得出，该蚯蚓接种密度处理效果最佳），25条左右清肠后大小相似的蚯蚓于土壤表面，将盖子中心掏空后盖上盖子以保持通风，和空白对照组、仅添加2,4-DCP的土壤均放于1.1节所述条件光照培养箱中，每组试验设3组平行，每天以衡重法控制含水率，每隔4 d检测土壤中2,4-DCP浓度，试验周期为28 d，试验结束后将每个样品混合均匀，采集土壤样品2 g和蚯蚓粪便样品0.2 g，进行微生物多样性测定.
土壤中2,4-DCP测定参考标准（HJ 998—2018）[16]，采用4−氨基安替比林分光光度法. 取1 g污染土壤（干土计）于离心管中，加入蒸馏水5 mL（包含土中水）后，放于超声振荡器中振荡30 min，4 000 r∙min−1离心10 min，重复2次合并上清液于510 nm波长下采用紫外分光光度计测量计算.
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将各样品与其平行组均附冰袋寄送至上海生工进行高通量测序. 样品分别命名为A：空白对照组土壤；B：2,4-DCP污染土壤；C：污染后添加蚯蚓土壤；D：蚯蚓粪便. 主要流程为：样品经预处理后，按OMEGA试剂盒说明进行全群落基因组DNA提取，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Qubit试剂盒精确定量DNA浓度以确保提取DNA的数量和质量. 随后进行两轮PCR扩增，PCR所用引物融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物341F和805R. 将同一样品的PCR产物混合后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，Qubit3.0荧光定量仪进行文库浓度分析，最后在Illumina Miseq平台进行高通量测序. 对各样本序列进行质控和过滤，得到各样本数据.
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2,4-DCP在土壤中的降解速率常数（k, d−1）由式（2）计算：
式中，Ct和C分别为t（d）时刻和试验开始时土壤中2,4-DCP的浓度（mg∙kg−1）.
使用SPSS 27.0软件对实验数据进行统计分析. 采用Probit概率单位回归法算出各浓度梯度及时间下2,4-DCP对蚯蚓的LC50值和置信区间. 统计图和表中数值均以平均数±标准差呈现，对图表中数据进行单因素方差分析（ANOVA），若与空白对照组具有显著差异则进行LSD多重比较来检验组间差异显著性，P<0.05、P<0.01表示差异显著，分别用*和**表示. 统计图由Origin 2022软件和R语言绘制，相关性图采用ChiPlot网站绘制.
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各浓度梯度2,4-DCP污染土壤中蚯蚓7 d和14 d的死亡情况数据见表1. 对表1数据使用SPSS 27.0中Probit程序进行回归性分析，结果如表2所示. 算得7 d的LC50值为29.55 mg∙kg−1，14 d的LC50值为28.76 mg∙kg−1. 从试验结果看，7 d和14 d的LC50值差异不大，仅相差0.79 mg∙kg−1，表明在2,4-DCP污染的土壤中，蚯蚓的死亡大多出现于前7 d，而7—14 d内死亡较少，与乔文鹏[17]等研究了马拉硫磷对蚯蚓的毒性时发现的现象相似，这是由于在土壤自净等作用下，减少了土壤中2,4-DCP的浓度，使得随着暴露时间的增加，2,4-DCP对蚯蚓的毒性减弱，具体分析见2.4节. 本研究中，当土壤中2,4-DCP浓度低于20 mg∙kg−1时，14 d内不会对蚯蚓造成生命威胁，而当浓度高于35 mg∙kg−1时，14 d内几乎无蚯蚓存活.
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当蚯蚓接触到环境中的污染物时，体内会产生大量的活性氧（ROS），正常情况下，ROS由新陈代谢过程生成，其生成和消失处于动态平衡状态，若破坏了这种动态平衡，过多的ROS则会导致细胞凋亡和坏死[18]. SOD是一种在超氧阴离子向H2O2转化过程中起着关键作用的金属酶，是蚯蚓抗御ROS的首要防御机制，可作为蚯蚓受污染物胁迫的重要表征[19].
蚯蚓体内SOD活性变化如图2（a）所示，随着时间的推移，各浓度2,4-DCP污染下蚯蚓体内SOD活性均呈现出不同程度的下降趋势. 第3天时，蚯蚓体内SOD活性随浓度增加呈现出先上升后下降的趋势，于10 mg∙kg−1处达到峰值，为138.33 U∙mg−1，与空白对照组具有显著差异（P<0.01）；此时间段各浓度下蚯蚓体内SOD活性均高于对照组，表明蚯蚓体内的SOD在3 d时保护了细胞使其免受ROS的损伤，且保护程度随浓度升高而削减. 第7天时，蚯蚓体内SOD活性仍然随浓度上升呈现出先上升后降低趋势，并于5 mg∙kg−1处达到峰值，为119.34 U∙mg−1，但与对照组不具显著差异，而15 mg∙kg−1浓度下SOD活性显著低于空白对照组（P<0.05），表明此时此浓度下蚯蚓受到环境胁迫，使ROS已得到大量的积累，超出SOD的清除范围. 14 d时，蚯蚓体内SOD活性随浓度增加呈下降趋势，且均低于空白对照组，此时SOD不起到保护反而表现出受抑制作用. 总体来看，本研究中的各浓度梯度下，蚯蚓体内SOD活性大致体现出短时间内增加，长时间处减少的效应，且浓度越高，时间越长，下降越明显. 王轶等[20]研究了莫能菌素对蚯蚓SOD活性的影响，随时间延长蚯蚓体内SOD活性远低于对照组，与本试验结果类似.
经过SOD催化超氧阴离子向H2O2的转化过程后，H2O2等自由基在其它重要酶如CAT等的作用下被清除[21]. CAT存在于线粒体、过氧化物酶体和细胞质中，可将H2O2分解为H2O和O2[22]. 试验过程中蚯蚓体内CAT活性变化如图2（b）所示，试验期间各浓度梯度下，蚯蚓体内CAT活性随时间延长总体呈缓慢上升趋势，这与SOD活性变化完全相反. 3 d时，蚯蚓体内CAT活性随浓度增加无明显规律性，且相对于空白对照组无显著差异，表明此时CAT尚未被激活，蚯蚓体内ROS的清除大多依靠SOD酶的作用. 7 d时，蚯蚓体内CAT活性随浓度增加呈上升趋势，且几乎均高于空白对照组，于15 mg∙kg−1及以上浓度暴露下差异显著（P<0.05），表明此时CAT已被激活，起到抗氧化作用. 14 d时，CAT活性随浓度增加呈现出先上升后降低趋势，相较于7 d，在低浓度暴露下，蚯蚓体内的CAT活性仍有所上升（P<0.01），而高浓度暴露下却有所降低，但均高于空白对照组，表明此时CAT仍然处于激活状态，同时也受到一定抑制.
MDA是机体组织和细胞内的脂质过氧化指标，其含量变化可作为表达细胞膜是否受损的信号[23]. 本试验中蚯蚓体内的MDA含量变化见图2（c），随时间延长，各浓度下蚯蚓体内的MDA含量均呈现出缓慢上升趋势，但3 d和7 d时与对照组之间差异不显著. 3 d时，相对于空白对照组，MDA含量变化不明显，且部分低于空白对照组，表明此时有机污染物激活了蚯蚓的抗氧化酶活性从而使细胞避免了ROS损害. 7 d时，虽各浓度下蚯蚓体内MDA含量还无明显差异，但均高于空白对照组，而14 d时各浓度下蚯蚓体内MDA含量增加明显，呈现出随浓度增加而上升的趋势，10 mg∙kg−1及以上浓度与空白对照组均具有显著差异（P<0.05）. 总体来说，土壤中2,4-DCP浓度越高，暴露时间越长，ROS在蚯蚓体内生成的越多，超出了抗氧化系统的清除能力，从而导致MDA含量的升高，主要机理如图2（d）所示. 因此，MDA的变化可以作为2,4-DCP对蚯蚓毒力影响的一个重要指标.
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蚯蚓的组织病理学改变在近年的毒理学中应用日益广泛. 组织细胞的改变依赖于机体对损伤的修复能力、污染物的性质以及接触的持续时间[24]. 表皮和肠道分别是蚯蚓在土壤环境中直接接触和消化吸收污染物的关键组织，一旦受损，则会引起一系列的病理变化，进而影响其存活[25]. 本试验中暴露于2,4-DCP污染土壤中的蚯蚓体壁和肠道组织细胞结构变化见图3. 图3（a）和图3（d）为空白对照组蚯蚓体壁和肠道细胞分布结构，具有规则且完整的细胞结构. 图3（b）和图3（c）分别为土壤中2,4-DCP浓度为15 mg∙kg−1和25 mg∙kg−1时暴露14 d蚯蚓体壁细胞结构变化图，图3（b）中观察到部分表皮细胞发生破裂和凹陷，环肌和纵肌均无明显变化. 图3（c）中可明显观察到蚯蚓表皮受损，细胞呈现出不规则的排列方式，环肌厚度减小，纵肌细胞间隙扩大. 图3（e）和图3（f）是暴露于15 mg∙kg−1和25 mg∙kg−1浓度14 d蚯蚓肠道组织细胞结构变化图. 图3（e）中，与空白对照组相比，肠上皮细胞可观察到绒毛间隙扩大，但不明显，而图3（f）中可以明显观察到肠上皮细胞破裂和间隙扩大，且具有疑似增生现象. 总体来看，2,4-DCP暴露浓度越高，蚯蚓体壁和肠道细胞组织变化越明显，且随暴露浓度增加，蚯蚓体壁从仅表皮细胞破裂演变为表皮细胞排列不规则、环肌厚度减小和纵肌细胞间隙扩大，肠上皮细胞从间隙扩大演变为细胞破裂. 结合上述观察和前文蚯蚓抗氧化系统分析结果，推测蚯蚓细胞组织损伤可能与其抗氧化系统受抑制有关[26].
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相较于致死效应的测试指标LC50，趋避性试验中蚯蚓对2,4-DCP的反应更加灵敏，蚯蚓对2,4-DCP的回避效应见图4（a），在设定空白对照组中两室均为清洁土壤时，蚯蚓无回避率的情况下，各浓度2,4-DCP梯度下蚯蚓的回避率均为正值，随浓度增加呈上升趋势，均与对照组具有显著差异（P<0.01）. 有研究表明，当洁净土壤中蚯蚓的数目高于总蚯蚓数的80%，即回避率高于60%时，则此污染土壤浓度不适合蚯蚓生存[27]. 本试验结果中，即当土壤中2,4-DCP浓度达到10 mg∙kg−1时已不适合蚯蚓生存，而2,4-DCP污染土壤对蚯蚓7 d的LC50值和14 d的LC50值分别为29.55 mg∙kg−1和28.76 mg∙kg−1，大约为前者的3倍，与黄盼盼等[28]在研究石油污染土壤对蚯蚓的回避行为影响时，得出的结论类似.
如图4（b）所示，在土壤中添加2,4-DCP后，测得土壤中2,4-DCP浓度随时间增加呈显著下降趋势，且试验前期下降速度明显，这主要由于土壤对2,4-DCP的吸附等自净作用[29]. 这也是毒性试验中，蚯蚓的死亡大多出现在前7 天的原因，土壤的自净作用减小了2,4-DCP对蚯蚓的毒性. 土壤中2,4-DCP的降解动力学符合一级衰减动力学模型，在土壤自然老化和存在蚯蚓条件下其降解速率常数分别为0.08（R2=0.96, P<0.01）和0.2（R2=0.99, P<0.01）. 试验第4天测得，未添加蚯蚓组和蚯蚓组之间2,4-DCP浓度差异并不明显，而第8天及以后，添加蚯蚓组土壤中2,4-DCP浓度均显著低于无蚯蚓组（P<0.01），且于16 d后趋于稳定，24 d后低于检出限（红圈处后）. 第4天测得两组土壤中2,4-DCP的降解速度相似，这是因为在试验过程中，蚯蚓刚接触2,4-DCP污染土壤后并不活跃，居于土壤表面的蚯蚓较多；而4 d后，土壤表面的蚯蚓明显减少，此时蚯蚓已适应土壤环境，相比于未添加蚯蚓土壤，添加蚯蚓的土壤中2,4-DCP的降解速度明显增高. 此外，试验过程中对蚯蚓体内的2,4-DCP含量进行了检测，其中并未检出，由此推断蚯蚓的穿梭活动等行为促进了土壤中2,4-DCP的降解.
蚯蚓具有避光性，在土壤含水率适宜的条件下多出现于土壤深处以寻求阴暗潮湿环境[30]. 当蚯蚓与潜在的致命和非致命源接触时，就会产生巴普洛夫条件反射，从而逃离污染，这就是所谓的“趋避”[31]. 本试验中，各浓度梯度下2,4-DCP对土壤中蚯蚓7 d、14 d的竖直方向分布情况分别如图4（c）、图4（d）所示，无污染情况下，大部分蚯蚓居于塑料盒底部3 cm范围内，且大多出现在塑料盒的底部，但随2,4-DCP浓度的增加，蚯蚓向土壤深层迁移的比例越来越小（P<0.01），严重改变了蚯蚓的行为特征，30 mg∙kg−1和35 mg∙kg−1浓度下蚯蚓7 d内几乎均留存在土壤表面，并且呈现出明显的抱团、蜷曲和浮肿等中毒现象. 14 d时观察到，除35 mg∙kg−1浓度下，随着时间变化，蚯蚓有向土壤深层迁移的趋势，这与蚯蚓的适应性和土壤中2,4-DCP含量变化有关.
简而言之，从趋避试验和竖直方向分布试验结果来看，土壤中2,4-DCP浓度越高，对蚯蚓的行为特征影响越明显. 另一方面，结合两组样品土壤中2,4-DCP降解曲线结果得出，当蚯蚓行为不受明显限制时，其也可通过活动促进土壤中2,4-DCP降解.
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各样本多样性指数结果如表3所示，使用OTU对样本中测得的序列数进行聚类划分. Shannon、Simpson为衡量样本中微生物多样性指数，Chao和ACE用于估算物种总数，Coverage为覆盖率，此次结果中各样本的Coverage值保留两位小数后皆为1，证明结果具有可信性.
由表3分析得出，蚯蚓粪便中的各多样性指数均与对照组土壤呈显著差异，意味着其微生物的总数和多样性显著低于土壤样本，这主要由蚯蚓肠道独特的厌氧环境导致[32]. 土壤样品中，添加2,4-DCP土壤样品的Chao和Ace值显著低于对照组，表明2,4-DCP的投入对土壤微生物结构可造成严重影响. 此外，2,4-DCP为内分泌干扰物，对微生物的生长也存在抑制作用[33]. 而相较于对照组，同时添加2,4-DCP和蚯蚓的土壤中其各多样性指数值又有所上升，且其Chao、Ace和Shannon指数与对照组均不具显著差异，使得微生物群落多样性得到了有效提升. 在蚯蚓的活动下，土壤颗粒被分散并重新组合，形成新的聚合体和特殊的微观结构，为微生物生长提供了良好条件[34].
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图5（a）为门水平分布Circos图，展现了各样本前8个优势菌门的分布情况. 其中，变形菌门（Proteobacteria）在土壤和蚯蚓粪便中占有绝对优势，丰度均超过50％，且未添加蚯蚓的土壤样本中，Proteobacteria的占比较高，均达到70％以上. 2,4-DCP的投入使土壤样本中除变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）外大多优势菌门丰度下降，如酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和未分类菌门（unclassified_Bacteria）等. 而投加蚯蚓后，土壤中拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度明显增加，从对照组、仅添加2,4-DCP组中的5.75％、7.17％增长到32.12％，同时，优势菌门中的疣微菌门（Verrucomicrobia）也具有与此相似的丰度变化. 此外，相比于土壤，蚓粪中优势菌门种类较少，其丰度>1％的菌门仅有变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）.
按属对微生物群落组成进行进一步分类，各样本属水平上物种丰度及分层聚类如图5（b）所示. 由聚类树状图可以看出，A和B样本具有相似性，且其优势菌属种类大致相同，但各菌属丰度具有明显差异，其余样本不具相似性. 对照组土壤样本中芽殖杆菌属（Gemmobacter）丰度最大，占据29.14％，而2,4-DCP的添加使其丰度明显下降，仅有11.92％，但也有部分菌属丰度上升，如溶杆菌属（Lysobacter）等. 土壤中的优势菌属种类明显高于蚯蚓粪便，且土壤样品中，投加蚯蚓组中种类最多. 投加蚯蚓土壤的优势菌属中同样包含了蚓粪的优势菌属，如气单胞菌属（Aeromonas）和黄杆菌属（Flavobacterium），分别占据总数的39.04％和27.28％. 因此，从属分类上来看，蚯蚓大幅提高了土壤微生物群落多样性.
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取前40个优势OTU绘制环境因子（2,4-DCP、蚯蚓和蚓粪）与OTU之间相关性图，如图6所示，图6（a）为土壤中OTU与2,4-DCP、蚯蚓活动和蚓粪的正相关性图，图6（b）为2,4-DCP和蚯蚓与土壤中OTU的负相关性图，分别表示2,4-DCP和蚯蚓造成丰度增加和减少的OTU种类及其属分类情况. 正相关性图中的OTU有39种，边数达到50条，而负相关性图中的OTU仅有24种，边数只有25条，均显著低于正相关.
本试验中，门水平上，2,4-DCP使土壤中酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、糖化细菌门（Candidatus_Saccharibacteria）和未分类菌门（unclassified_Bacteria）丰度均有所减少，从而导致变形菌门（Proteobacteria）丰度增加. 属水平上，芽孢杆菌属（Gemmobacter）丰度大大减少，从29.14％降至11.92％，但同时也存在一些丰度增加的菌属，其大多属于变形菌门（Proteobacteria），主要包括溶杆菌属（Lysobacter）、湖沉积杆菌属（Limnobacter）、黄色土杆菌属（Flavihumibacter）、短波单胞菌属（Brevundimonas）和噬氢菌属（Hydrogenophaga）等. 通过相关文献调查发现，这些菌属几乎均具有降解有机物的功能[35 − 38]. 由此推断出，自然条件下，土著微生物也可能推动土壤中2,4-DCP的降解.
在引入蚯蚓后，可以观察到相较于另外两个土壤样本，一些菌属丰度明显上升，且这些菌属在蚓粪中丰度很低，其大多为好氧菌属，主要由蚯蚓活动引起. 蚯蚓通过挖掘等活动能提高土壤的通风性能进而为土壤微生物提供足够的氧气，因此，蚯蚓活动促进了土壤中好氧菌属的繁殖[39]. 本次测序结果中，这些菌属主要为假单胞属（Pseudomonas）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）和单胞菌属（Arenimonas）等. Pseudomonas为自然界中普遍存在的菌属，具有高效降解酚类化合物能力，是芳烃废水处理领域中常见菌属[40]；Sphingobacterium不仅具有降解芳香族化合物的能力，还能将甲酸、苯酚和环己酮等污染物转化为其他产物[41]；Arenimonas对含有苯环结构的酚类、醌类有机物具有降解作用[42]，这些好氧菌属与蚯蚓活动密切相关.
蚯蚓肠道内环境特殊，具有丰富的氨基酸，其中湿度较高，氧气含量很低，故细菌结构与土壤具有很大差异[43]. 此外，蚯蚓肠道内pH呈中性，并在有机酸和黏膜糖等的作用下使摄入的土壤优势菌属丰度大幅度减少[44]. 本研究中，门水平上，土壤中酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）均属于优势菌门，但蚓粪中却丰度很低. Acidobacteria多属于寡营养且嗜酸类群，蚯蚓肠道的中性和丰富的有机酸环境抑制了其增殖[45]，而Actinobacteria大多为好氧菌，故于蚯蚓肠道中难以存活. 拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度在蚯蚓生存土壤和蚯蚓肠道之间丰度较高，明显高于未添加蚯蚓土壤，由此推断，拟杆菌门（Bacteroidetes）的升高主要由蚓粪引起. 拟杆菌门（Bacteroidetes）中的黄杆菌属（Flavobacterium）是蚯蚓粪便中的优势菌属，相对丰度达到27.28％，使得投放蚯蚓的土壤中也具有较高丰度，达到11.95％. 黄杆菌属（Flavobacterium）是蚯蚓肠道中重要的反硝化菌属，具有脱氮功能，能有效降解环状有机污染物[46 − 47]. 同时，由蚓粪产生所引起的土壤中丰度显著增加的菌属还有变形菌门（Proteobacteria）中的气单胞杆菌属（Aeromonas），气单胞杆菌属（Aeromonas）在很多生物的肠道中均为优势菌属，是环境中较为常见的反硝化菌属，具有参与氮的转化功能[48].
综上所述，土壤中2,4-DCP的投入可显著影响土壤微生物群落数目和多样性，但土著微生物也可能具有一定自然修复的能力. 蚯蚓的投入可使2,4-DCP污染土壤中的微生物多样性得到一定程度上的恢复，其活动、排泄蚓粪所分别产生的好氧、厌氧菌属可能是促进2,4-DCP降解的重要因素.
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本研究所设土壤中2,4-DCP浓度均可对蚯蚓造成氧化胁迫；低浓度暴露（5 mg∙kg−1）对蚯蚓行为无明显影响，且可被蚯蚓体内的抗氧化系统平衡和缓解；随暴露浓度的升高，蚯蚓的抗氧化系统逐步受到抑制，行为受到影响，进而形成细胞损伤及各种中毒现象，死亡率增加.
2,4-DCP可减少土壤微生物群落数目和多样性，但添加蚯蚓后可使其得到一定程度上的恢复. 由蚯蚓活动而生的好氧菌属及蚓粪所携带的厌氧菌属对土壤中2,4-DCP的降解起到重要作用.
在土壤生态系统中，目前人们对污染物的生态毒理方面研究大多只关注了污染物本身对生物体的毒性. 但另一方面，关于土壤生物对污染物的自然降解以及土壤动物如蚯蚓在此过程中对土壤菌群的影响和修复研究还较缺乏. 本试验结果推测出，蚯蚓可改变土壤中微生物群落结构以促进2,4-DCP的降解，由此可联想到，对于某一污染物，筛选出蚯蚓在处理过程中所生成的新型高效降解菌属，或许能成为修复此类有机物污染土壤的重要手段.
蚯蚓对2,4-DCP污染土壤的毒性响应及微生物群落影响
Toxic response of earthworms (Eisenia fetida) to 2,4-DCP contaminated soil and the impact of microbial community
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摘要: 2.4-二氯苯酚(2.4-DCP)作为合成农药、医药的中间体，在我国广泛生产和使用，其生态危害性已引起广泛关注. 然而，关于土壤动物、微生物对2.4-DCP的毒性响应知之尚少. 基于此，本研究以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为受试生物，从致死浓度、抗氧化系统、病理学和行为特征角度评价2.4-DCP对蚯蚓的毒性，通过高通量测序分析土壤微生物群落变化. 此外，还探讨了蚯蚓对土壤中2.4-DCP的降解动力学和微生物多样性影响. 结果表明，2.4-DCP对蚯蚓7 d半致死浓度(LC50)值为29.55 mg∙kg−1，14 d为28.76 mg∙kg−1；蚯蚓体内超氧化物歧化酶(SOD)随暴露时间、浓度增加总体呈下降趋势(P<0.01)，而过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)呈缓慢上升趋势(P<0.01)；当2.4-DCP暴露浓度为15 mg∙kg−1时，14 d可使蚯蚓表皮细胞发生凹陷并破裂，浓度达到25 mg∙kg−1时，蚯蚓表皮细胞丧失规则细胞排列结构，肠上皮细胞发生细胞间隙扩大和破裂现象；2.4-DCP浓度越高，对蚯蚓的行为特征影响越明显；2.4-DCP在添加蚯蚓和未添加蚯蚓土壤中的降解动力学均符合一级动力学模型，在添加蚯蚓土壤中的降解速率(0.20 d−1)明显高于未添加(0.08 d−1)；2.4-DCP可抑制土壤微生物群落多样性，但蚯蚓活动、蚓粪的产生可分别增加土壤中一些具有降解有机物功能的好氧、厌氧菌属丰度. 本研究旨在揭示2.4-DCP与土壤动物及微生物的相互作用关系，为综合评价2.4-DCP的毒性和风险提供理论参考.Abstract: 2,4-dichlorophenol(2,4-DCP), as an intermediate in the synthesis of pesticides and pharmaceuticals, is widely produced and used in China, and its ecological hazard has aroused widespread concern. However, little is known about the toxic response of soil animals and microorganisms to 2,4-DCP. Based on this, this study took Eisenia fetida as the test organism, evaluate the toxicity of 2,4-DCP to earthworms from the perspective of lethal concentration, antioxidant system, pathology and behavioral characteristics, and analyze the changes of soil microbial community through high-throughput sequencing. In addition, the degradation kinetics and microbial diversity of 2,4-DCP by earthworms were also discussed. The results showed that the LC50 value of 2,4-DCP to earthworms was 29.55 mg∙kg−1 for 7 days, and 28.76 mg∙kg−1 for 14 days; The superoxide dismutase (SOD) in earthworms decreased with the increase of exposure time and concentration (P<0.01), while catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) increased slowly (P<0.01); When the exposure concentration of 2,4-DCP is 15 mg∙kg−1, the earthworm epidermal cells can be dented and ruptured for 14 days, when the concentration reaches 25 mg∙kg−1, the earthworm epidermal cells lose the regular cell arrangement structure, and the intestinal epithelial cells have the phenomenon of cell gap expansion and rupture; The higher the concentration of 2,4-DCP, the more obvious the effect on the behavioral characteristics of earthworms; The degradation kinetics of 2,4-DCP in the soil with and without earthworms conforms to the first-order kinetic model, and the degradation rate in the soil with earthworms (0.20 d−1) is significantly higher than that in the soil without earthworms (0.08 d−1); 2,4-DCP can inhibit the diversity of soil microbial community, but the activity of earthworms and the production of earthworm manure can respectively increase the abundance of aerobic and anaerobic bacteria in the soil that have the function of degrading organic matter. The purpose of this study is to reveal the interaction between 2,4-DCP and soil animals and microorganisms, and provide theoretical reference for comprehensive evaluation of 2,4-DCP toxicity and risk.
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Key words:
- 2,4-DCP /
- Eisenia fetida /
- toxic effects /
- microbial diversity.
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图 1 自然土壤法染毒中2,4-DCP浓度设计（红框内为亚致死浓度）
Figure 1. Design of 2,4-DCP concentration in natural soil exposure（sublethal concentration in the red box）
图 2 2,4-DCP对蚯蚓体内SOD活性（a）、CAT活性（b）、MDA含量（c）的影响和机理图（d）注：*表示P<0.05，**表示P<0.01.
Figure 2. Effects of 2,4-DCP on SOD activity （a）, CAT activity （b）, MDA content （c） in earthworms and mechanisation （d） Note: * represents P<0.05, ** represents P<0.01.
图 3 蚯蚓体壁和肠道细胞组织变化图
Figure 3. Histological changes of earthworm body wall and intestinal cells
图 4 蚯蚓的趋避性（a）、土壤中2,4-DCP的降解规律 （b）、分布情况7 d（c）和14 d（d）
Figure 4. Antagonism of earthworms（a）, degradation of 2,4-DCP in soil（b）, distribution 7 d（c） and 14 d（d）
图 5 对照组土壤、2,4-DCP污染土壤、蚯蚓修复土壤和蚓粪微生物群落门（a）和属（b）水平分布图
Figure 5. Horizontal distribution map of phyla （a） and genus （b） of microbial communities in CK soil, 2,4-DCP contaminated soil, earthworm remediation soil and earthworm feces
图 6 2,4-DCP、蚯蚓和蚓粪与优势OTU之间的相关性图正相关（a）和负相关（b）
Figure 6. The positive correlation （a） and negative correlation （b） of the correlation diagram between 2,4-DCP, earthworm and earthworm dung and the dominant OTU
表 1 自然土壤法测得各浓度2,4-DCP梯度下蚯蚓死亡率（%）
Table 1. Mortality rate of earthworm under the gradient of 2,4-DCP measured by natural soil method（%）
时间/d
Time2,4-DCP浓度/（mg∙kg−1）
Concentration20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 7 0 3.33±5.77 13.33±5.77 26.67±11.55 53.33±5.77 66.67±15.28 93.33±5.77 100 14 0 6.67±5.77 16.67±5.77 33.33±15.28 53.33±5.77 80±10 96.67±5.77 100 注：空白对照组中无蚯蚓死亡. Note: No earthworm died in the blank control group. 
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表 2 自然土壤法测得2,4-DCP对蚯蚓的LC50
Table 2. LC50 of 2,4-DCP to earthworm measured by natural soil method
时间/d
time毒性回归方程
Toxicity regression equations卡方值
Chi−square显著性
SigLC50（95％置信限）/（mg∙kg−1）
LC50（95％ CL）7 y=17.447x-25.656 1.269 0.973 29.546（27.992—31.142） 14 y=17.313x-25.257 1.332 0.970 28.763（27.226—30.317）
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表 3 各样本多样性指数结果
Table 3. The diversity index results of each sample
样品
Sample聚类
OTUs香农指数
ShannonChao1指数
ChaoACE指数
Ace辛普森指数
Simpson覆盖率
Coverage空白对照组土壤
Soil of blank control group857±16 4.60±0.09 862.00±14.74 860.02±13.92 0.09±0.02 1.00 2,4-DCP污染土壤
2,4-DCP contaminated soil700±33** 4.51±0.12 704.44±42.10** 703.67±41.83** 0.03±0.01** 1.00 污染后添加蚯蚓土壤
Pollution soil with earthworm685±41** 4.65±0.15 792.65±62.64 792.68±61.66 0.02±0.01** 1.00 蚯蚓粪便
Earthworm excrement225±15** 2.60±0.08** 309.91±33.41** 287.75±23.53** 0.17±0.03** 1.00 注：*表示P<0.05，**表示P<0.01.
Note:* represents P<0.05, ** represents P<0.01.
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