本研究构建了生物生态耦合工艺（biological and ecological reactor，B-ER），尺寸为410 cm×150 cm×170 cm，有效容积为5 000 L，工艺的具体参数见表1。如图1所示，B-ER包括生物段（厌氧生物膜、生物转盘、好氧生物膜）和生态段（异向磁场强化垂直流人工湿地、电场强化垂直流人工湿地、同向磁场强化垂直流人工湿地）。生物段构成A-O-O工艺，生态段构成外场强化耦合垂直流人工湿地技术。生物段中厌氧生物膜池填料为高度1m聚氨酯海绵生物膜球（直径10 cm）；生物转盘池下端填高度0.4 m聚氨酯海绵生物膜球（直径10 cm），上端为直径90 cm，厚度50 cm的生物转盘，转速为20 r · min⁻¹，盘片浸没率为40%；好氧生物膜池中有50 cm×120 cm×100 cm的YDT弹性填料。生态段中人工湿地水生植物美人蕉、菖蒲和梭鱼草种植密度均为6株· m⁻²，填料从上到下均为：沸石（粒径8~12 mm）、浮水陶粒（15~20 mm）和火山石（25~30 mm）。

以昆明市盘龙区西南林业大学污水厂调节池中的生活污水作为实验进水，耦合工艺采用连续式进水方式。试验前将沸石、浮水陶粒、火山石及生物膜球等基质填料和实验所需的电极材料、磁板材料用自来水冲洗干净后，置于耦合工艺中。本实验开始于2023年5月持续到2023年11月，实验测定前试运行30 d，稳定运行后，加入原水，探究在不同水力负荷下（0.7、1.0、1.3、1.6 m³·(m²·d)⁻¹）对污染物的净化效果，每个水力负荷运行1个月，然后在最优水力负荷下分析不同处理段对污染物的去除效果及微生物群落特征。实验进水水质为TP为1.41~9.11 mg·L⁻¹、NH₄⁺-N为12.89~68.32 mg·L⁻¹、COD为30~416 mg·L⁻¹、温度18.19~24.21 ℃、pH为7.12~8.19、电导率为210~1018 µS·cm⁻¹、氧化还原电位为-248.9~118.4 mV、溶解氧为2.19~4.38 mg·L⁻¹。

每隔6 d（上午9:00）进行采样，取水量为500 mL，取样后立即进行测定，每个处理段各设置1个固定的取水口，水质指标采样点为进水、生物段出水和生物+生态段出水，测定总磷(TP)、氨氮(NH₄⁺-N) 和COD等污染物指标，测定时每个样品要进行3次重复，并在当天取样时现场测定温度、pH、ORP和DO等物理指标进行测定。水质分析主要采用标准分析方法^[13]：总磷(TP)浓度测定采用钼酸铵分光光度法；氨氮(NH₄⁺-N)浓度测定采用纳氏试剂光度法；COD采用重铬酸钾微波消解法。温度、pH、溶解氧(DO)、氧化还原电位(ORP)和电导率（EC）采用哈纳多参数水质分析测定仪(III98194)场测定。

在最优水力负荷稳定运行30 d后，进行微生物采样测序。采用五点取样法对上、中、下层进行取样，每层5个样品最终混为1个样，每个单元共采集3个样品。依次标记为I-1(I-1-1、I-1-2、I-1-3)、I-2(I-2-1、I-2-2、I-2-3)、I-3(I-3-1、I-3-2、I-3-3)、I-4(I-4-1、I-4-2、I-4-3)、I-5(I-5-1、I-5-2、I-5-3)、I-6(I-6-1、I-6-2、I-6-3)。I-1~I-6分别是：厌氧生物膜、生物转盘、好氧生物膜、异向磁场强化垂直流人工湿地、电场强化垂直流人工湿地、同向磁场强化垂直流人工湿地。共计采集18个样品，将样品带回实验室进行预处理。每个样品取50 g混匀后放入灭菌的锥形瓶中，加入去离子水，振荡5 min后，转50 mL离心管中，离心机离心6 min后倒掉上清液，取其沉淀保存于-80 ℃低温环境下，工作人员来实验室取样送至上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序分析。

所有实验数据采用Excel2018和SPSS22.0软件进行分析，采用Origin2022软件进行图形绘制，细菌群落结构的组成、α和β多样性分析及功能预测均使用凌波微课平台出图，使用派森诺基因云平台进行冗余分析(RDA)。

水力负荷是人工湿地中一个非常重要的参数，对其降解污染物能力具有重要影响。B-ER在不同水力负荷下对污染物的去除率如图2所示，在0.7、1.0、1.3、1.6 m³·(m²·d)⁻¹不同水力负荷下，随着水力负荷的增大，TP、NH₄⁺-N和COD的去除率呈现先增加后减少的趋势。当水力负荷为1.3 m³·(m²·d)⁻¹时，对污染物的去除效果最好，TP、NH₄⁺-N和COD的平均去除率分别为74.53%、98.35%、97.06%。研究表明，在水力负荷较大的情况下，水力停留时间缩短，不利于微生物的硝化和反硝化作用，容易造成基质填料的堵塞，从而产生较高浓度的氮和磷酸盐；适当的水力负荷提高了基质的复氧能力，有利于生物化学作用，出水浓度也较为稳定^[14]。其中对NH₄⁺-N和COD的净化效果尤其明显，出水浓度均优于《云南省农村生活污水处理设施水污染物排放标准》（DB53/T 953-2019）一级 A 标准，与前人研究结果相比^[15-17]，对污染物的去除率提高了11.11%~15.63%，表明B-ER对污染物的去除效果有较大的提升，可能是因为污水含有少量的NH₄⁺-N，利于微生物的反硝化脱氮作用的进行，所以B-ER能够对氨氮保持较高的去除率。生物段中生物膜的吸附作用和基质填料的过滤作用对COD都有较好的去除效果。总的来说，整个工艺为脱氮除有机物型生物生态耦合工艺，对于COD的去除表现优秀，可用于COD浓度较高的地区使用。

各处理段污染物浓度、去除率以及削减量如图3所示。可见，不同处理段污染物的去除率和削减量均逐渐增加，去除贡献率呈现先增加后降低的趋势。生物段对TP、NH₄⁺-N和COD平均去除贡献率分别为41.24%、88.41%和86.44%，可以看出，污染物在经过生物段时，浓度下降较大，生物段的TP、NH₄⁺-N和COD的出水浓度分别为2.34、5.46、25.31 mg·L⁻¹。与生物段相比，生物+生态段对应的平均去除率提高了29.96 %、11.62 %和11.32 %。生物段对TP、NH₄⁺-N和COD的平均污染物削减量分别为13.12 、299.55和1284.44 g·d⁻¹，而生物+生态段分别提高了9.55 、40.62和168.89 g·d⁻¹。综上所述，生物段是污染物去除的主要场所，生态段对污染物的去除效果并不显著，原因可能是污染物进水浓度不高，在经过第一段生物段时，浓度就大幅度降低，导致进入第二段生态段的进水浓度很低，生态段并未能完全发挥作用，导致生态段对污染物的去除效果提高并不明显。可以看出，生物段可以较好地去除污水中的污染物，这减少了生态段的负担。在生物生态耦合工艺中，污染物的去除主要发生在生物段，这与雷茹、胡成琼的研究结果一致^[16,18]。其中对污染物的去除贡献率及削减量均在好氧生物膜处达到最大，TP、NH₄⁺-N和COD去除贡献率分别是22.27%、45.32%、44.60%，TP、NH₄⁺-N和COD的污染物削减量为7.08、155.32、663.11 g·d⁻¹，好氧生物膜池属于好氧区域，污水中大部分的有机物在这一区域被好氧微生物分解为CO₂和H₂O。

研究发现，氮的主要去除途径主要是细菌的硝化和反硝化作用^[19]。门水平微生物群落组成如图4所示，将相对丰度>1%的门作为主要的菌门，共发现10个菌门，分别是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteriota)、热脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、硝化螺旋菌门(Nitrospirota)、髌骨细菌门(Patescibacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadota)。在门分类水平下对N类污染物去除起到主要作用的为变形菌门和硝化杆菌门^[20]，其中前8个菌门为系统的优势菌门，在I-1至I-6不同处理段中相对丰度分别是91.29%、91.31%、93.64%、92.00%、86.88%和84.33%。优势菌门种类无较大差异，但是细菌的相对丰度略有差异^[21]，这可能是因为不同的处理段环境不同从而导致细菌群落结构发生变化。Proteobacteria在整个系统中占比最高，其包含了许多硝化和反硝化细菌，主要是通过反硝化作用对N类污染物进行去除，在脱N除COD过程中发挥着重要作用^[22]。Bacteroideta是专性厌氧细菌，有助于含氮物质的利用及大分子物质水解等，所以在N类污染物去除的过程中也起着重要作用^[23]。Proteobacteria和Bacteroideta是B-ER中占比最高的两大类微生物，对生活污水中N类污染物的去除起着重要作用。Chloroflexi是不产氧光合细菌，Firmicutes 属于典型的厌氧细菌，二者均可促进有机物的降解^[24]，这可能是B-ER对污水中COD高效去除的原因之一。Firmicutes和 Bacteroidetes 能降解多种污染，对污水中氮的去除以及维持稳定具有较大贡献^[25]。

生物+生态段中Proteobacteria占主导地位且相对丰度大于生物段（48.80%>41.72%），本研究的结果与李娟红等^[26]的研究结果相似。同时，国内外不少报道也指出，大多数具有去除COD以及反硝化除N功能的细菌均来自于Proteobacteria^[27]。生物+生态段中Nitrospirota的相对丰度大于生物段（2.74%>1.60%），原因可能是磁场的施加增加了Nitrospirota的生长和富集^[24]。而生物段中Chloroflexi相对丰度高于生物+生态段（10.14%>9.04%），表明生态段的加入抑制了此类细菌的生长，原因可能是生态段中电场和磁场的加入导致了Chloroflexi的减少，与彭丽萍等^[12]研究结果一致。Proteobacteria、Bacteroidot及Nitrospirota等优势菌门共同作用于污水中的污染物，保持着优秀的去除效果，形成了B-ER中复杂的群落结构，保障了耦合工艺良好的处理性能。

属水平相对丰度前30的微生物群落组成如图5所示，生物段和生物+生态段中共有的优势菌属有Novosphingobium、Nitrospira、Reyranella属、BD1−7 clade、Sphingomonas、Chlorobium和Desulfobulbus。生物段中共发现优势菌属10种，分别为新鞘氨醇菌属（Novosphingobium，3.25%）、绿菌属(Chlorobium，2.82%)、BD1−7 clade (2.56%)、Reyranella (2.53%)、脱硫微杆菌属(Desulfomicrobium，2.44%)、脱硫球茎菌属(Desulfobulbus，1.71%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira，1.56%)、Ottowia属(1.26%)、互养棍状菌属(Syntrophorhabdus，1.20%)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas，1.03%)。生物+生态段共发现优势菌属11种，分别是Nitrospira (2.72%)、Novosphingobium (2.48%)、Sphingomonas (2.46%)、发菌属(Terrimonas，1.93%)、Reyranella (1.86%)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas，1.85%)、BD1−7 clade (1.69%)、Chlorobium (1.42%)、根瘤杆菌属(Rhizobacter，1.32%)、Desulfomicrobium (1.26%)和Comamonas (1.14%)。生物+生态段提高了Nitrospira和Sphingomonas的相对丰度。不同的处理段都有特有的菌种存在，在运行期间菌属丰度在不断的发生变化。Nitrospira是一类革兰氏阴性细菌，属于亚硝酸盐氧化细菌，可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，对脱氮具有重要作用^[28]。李海峰等^[29]研究表明Sphingomonas在污水除磷方面应用潜力较好，所以生物+生态段提高了耦合工艺对磷的去除效率。Novosphingobium属于α-变形菌纲，可以参与氨的代谢，对污染物氨氮的去除起着重要作用^[30]。生物段为核心处理单元，对污染物的去除主要以生物膜的截留和吸收作用以及微生物降解作用，而生态段作为深化处理单元，可进一步提高污染物的去除效率^[31]。

表2描述了细菌的多样性和丰富度，量化的指标包括：Shannon、ACE和Chao1等指数。α多样性指数主要反映环境样品内的物种多样性，多样性指数越高，代表物种多样性越高。ACE指数和Chao1指数反映了细菌群落丰富度，Shannon指数越大，多样性就越高。结果表明，生物段的Chao1指数和ACE指数为4249和4488，均低于生物+生态段的4406和4637，两个指数均表明生物+生态段中微生物群落更加丰富。生物+生态段Shannon指数为6.4455，生物段为6.3450），说明细菌多样性生物+生态段较为丰富。外加同向磁场-垂直流人工湿地（I-6）的Chao1和Shannon指数均大于其他单元，即I-6中物种数和多样性较高。生物转盘池（I-2）和好氧生物膜池（I-3）的Simpson指数差异不大，但均明显高于厌氧生物膜球池（I-1），说明I-1中微生物的均匀程度较低。

功能预测结果如图6所示，B-ER对污水的净化是基质填料与微生物交互作用的结果，为解析B-ER内细菌群落功能变化，采用FAPROTAX对菌群进行功能预测分析。本研究在B-ER中发现优势细菌功能类群有化能异养(chemoheterotrophy)和好氧化能异养(aerobic-chemoheterotrophy)菌群，这与伍建业等^[32]研究结果类似。这2种功能型菌群可将污水中的有机物转化为二氧化碳和水，通过硝化和反硝化过程，有效地将氨氮进行转化和去除，促进污水中磷的沉积和固定，从而减少水体中的氮、磷等浓度^[33]。其中，生物+生态段中化能异养和好氧化能异养高于生物段，化能异养菌群在生物+生态段和生物段中分别为19.64%、18.81%，好氧化能异养菌群分别为15.65%、12.62%。此外，还观测到与S相关的功能预测菌群，包括硫化物呼吸(respiration_of_sulfur_compounds)和硝酸盐呼吸(sulfate_respiration)，硝酸盐可利用硫化物作为电子供体实现自养反硝化，为强化脱氮途径之一。其中化能异养在好氧生物膜池（I-3）中占比最大，并且与其他处理单元之间存在显著差异(P<0.05)。表明污水中污染物的去除主要依赖于该两类功能细菌的进行。

由图7可知，采用RDA分析优势菌门和属的相对丰度与污染物之间的关系。工艺会改变污水中溶解氧（DO）、pH、温度（T）、电导率（EC）和氧化还原电位（ORP），这些物理因子及污染物浓度会对细菌群落结构产生一定的影响。门水平中Proteobacteria和Nitrospirota与TP、NH₄⁺-N、COD去除率及水中的DO、ORP和温度（T）呈正相关(P<0.05)，与郭凤倩等^[9]研究结果一致，再次表明Proteobacteria对污水中污染物的去除起着重要作用。此外，Desulfobacterota、Bacteroidota、Firmicutes和Chloroflexi与COD、TP、NH₄⁺-N浓度及水中pH、EC也呈正相关(P<0.05)，表明污染物浓度及物理因子影响着细菌群落。对优势菌属分析发现，Proteobacteria下的Novosphingobium、Thauera、Sphingomonas，Bacteroidota下的Roseomonas以及Nitrospirota中的Nitrospira与污染物去除及物理因子呈正相关(P<0.05)。 综上所述，水中的物理因子能够引起微生物菌群结构的变化，利于优势菌富集，再次表明Proteobacteria、Bacteroidota和Nitrospirota等优势菌是促进污染物净化的主要因素，水中的温度、pH、DO、ORP及EC也是影响细菌相对丰度及污染物去除的次要因素。

1) B-ER在不同水力负荷（0.7、1.0、1.3、1.6 m³·m⁻²·d⁻¹）稳定运行120 d，当水力负荷为1.3 m³·(m²·d)⁻¹时，对生活污水能够保持高效稳定净化，TP、NH₄⁺-N和COD去除率分别为74.53%、98.35%、97.06%，其中NH₄⁺-N和COD的出水浓度均优于《云南省农村生活污水处理设施水污染物排放标准》（DB53/T 95-2019）一级 A 标准。

2)对生物段和生物+生态段进行对比发现，生物+生态段对污染物的去除贡献率及削减量都大于生物段，生物段对TP、NH₄⁺-N和COD平均去除贡献率分别为41.24%、88.41%、86.44%，而生物+生态段提高了31.63%、11.40%和11.32%；对污染物的削减量提高了9.55、40.6和168.89 g ·d⁻¹。

3)生物段和生物+生态段中的共优菌门为变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门等4种，共优菌属有新鞘氨醇菌属、Reyranella、BD1−7 clade、硝化螺旋菌属、鞘氨醇单胞菌等7种，生物+生态段的提高了变形菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门的相对丰度，且α多样性指数更高，细菌多样性及丰富度更好。在B-ER中发现优势细菌功能类群为化能异养和好氧化能异养菌群，且生物+生段中的好氧化能异养菌高于生物段。

4)细菌群落与污水性质冗余分析表明：变形菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门等优势菌门是影响水中污染物去除的主要因素，同时，水中的温度、pH、DO、ORP及EC也是影响细菌相对丰度及污染物去除的次要因素。