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汞离子比色型荧光探针的合成与性质

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管怡晗, 黎广进, 刘盛华, 尹军. 汞离子比色型荧光探针的合成与性质[J]. 环境化学, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
引用本文: 管怡晗, 黎广进, 刘盛华, 尹军. 汞离子比色型荧光探针的合成与性质[J]. 环境化学, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
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GUAN Yihan, LI Guangjin, LIU Shenghua, YIN Jun. Synthesis and properties of colorimetric fluorescent probe for mercury ions[J]. Environmental Chemistry, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
Citation: GUAN Yihan, LI Guangjin, LIU Shenghua, YIN Jun. Synthesis and properties of colorimetric fluorescent probe for mercury ions[J]. Environmental Chemistry, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
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汞离子比色型荧光探针的合成与性质

  • 华中师范大学化学学院，农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉，430000

    • 通讯作者: Tel：027-67867706，E-mail：yinj@mail.ccnu.edu.cn
  • 基金项目:
    国家自然科学基金（21676113，21772054），湖北省杰出青年基金（18CFA079），华中师范大学学者名师支持项目（0900-31101090002）和华中师范大学高等院校基础研究与运营优秀博士学位论文培养经费（2019YBZZ029）资助

Synthesis and properties of colorimetric fluorescent probe for mercury ions

  • Central China Normal University, College of Chemistry, Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology of Ministry of Education, Wuhan, 430000, China

    • Corresponding author: YIN Jun, yinj@mail.ccnu.edu.cn
  • Fund Project: National Natural Science Foundation of China (21676113,21772054), Young Scholar of Hubei Province (18CFA079), Scholar Support Program of CCNU (0900-31101090002) and Excellent Doctorial Dissertation Cultivation Grant of CCNU from the Colleges’ Basic Research and Operation of MOE (2019YBZZ029)

  • 摘要:

    汞化合物在促进工业和制造业快速发展的同时，也带来了严重的环境污染。由于其毒性极强，易于渗透，难以代谢，在生物体内富集后容易造成长期伤害。因此，开发一种能够快速、简洁、准确检测汞离子的方法具有十分重要的意义。为此，本文发展了一个基于氧硫杂冠醚配体的汞离子特异性的比色型荧光探针。该探针能够通过比色及荧光高选择性检测汞离子，且干扰性小、灵敏快捷。探针可以与汞离子形成1: 1络合物，该络合物可以在碘离子作用下将汞离子从配合物中解离，利用该平衡可以对汞离子进行定量检测。特别值得提及的是，该探针能够用于细胞及活体中汞离子的可视化检测。

    Abstract:

    While mercury compounds promote the rapid development of industry and manufacturing industry, they also bring serious environmental pollution. Due to its high toxicity, easy penetrability and difficult metabolism, it is easy to cause long-term damage after aggregation in organisms. Therefore, it is of great significance to develop a rapid, simple and accurate method to detect mercury ions. Accordingly, a mercury-ion specific colorimetric fluorescent probe based on oxy-thio-crown ether ligand was developed. The probe could detect mercury ions through colorimetry and fluorescence with high selectivity, low interference, high sensitivity and quick response time. Moreover, the formed 1: 1 complex between probe and mercury ions could be dissociated in the presence of iodide ions, and the equilibrium could be applied in quantitative detection of mercury ions. In particular, the probe could be used to track mercury ions in living cells and in vivo.

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  • 图 1  汞离子探针MNC的合成。

    Figure 1.  Synthesis of probe MNC.

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    图 2  探针MNC（10−5 mol·L−1）在DMSO-H2O（V/V = 5:95）中分别加入金属离子Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cd2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Hg2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Li+、Al3+（10−4 mol·L−1）后的紫外-可见吸收光谱（a）、颜色变化（b）和荧光光谱（c）；（d）MNC和MNC-Hg在不同pH值下的最大荧光强度变化。λex = 550 nm

    Figure 2.  The UV-visible absorption spectra (a), color changes (b) and fluorescence spectra (c) of MNC (10−5 mol·L−1) in the mixture of DMSO-H2O (V/V = 5:95) in the presence of 10−4 mol·L−1difference metal ions(Cu2+, Zn2+, Mn2+, Ni2+, Cd2+, Pd2+, Pb2+, Co2+, Hg2+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Li+, and Al3+); (d) the maximum fluorescence intensity change of MNC (10−5 mol·L−1) and MNC-Hg at different pH values. λex = 550 nm

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    图 3  在DMSO-H2O（V/V = 5:95）体系中加入不同浓度的Hg2+（0−7×10−5 mol·L−1）后，探针MNC（10−5 mol·L−1）的吸收光谱（a）和荧光光谱（b），λex= 550 nm；（c）和（d）表示MNC的最大荧光强度变化（I672/I0）与Hg2+浓度的关系。

    Figure 3.  The UV-visible absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of MNC (10−5 mol·L−1) in the mixture of DMSO-H2O (V/V = 5:95) in the presence of difference concentrations of Hg2+ (0 − 7×10−5 mol·L−1), λex = 550 nm; (c) and (d) represent the relationship between the maximum fluorescence intensity change (I672/I0) of MNC and the concentration of Hg2+.

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    图 4  在DMSO-H2O（V/V = 5:95）体系中加入不同浓度的KI后，MNC-Hg的紫外吸收光谱（a）和荧光光谱（b）, λex = 550 nm；（c）和（d）表示MNC-Hg的最大荧光强度变化（I672/I0）与KI浓度的关系。

    Figure 4.  The UV absorption (a) and fluorescence (b) spectra of MNC-Hg in DMSO-H2O ( V/V = 5:95) system after adding KI with different concentrations, λex = 550 nm; (c) and (d) represent the relationship between the maximum fluorescence intensity change (I672/I0) of MNC-Hg and the concentration of KI.

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    图 5  （a）不同浓度MNC孵育后Hela细胞的存活率；（b）Hela细胞经MNC（10−5 mol·L−1）以及MNC（10−5 mol·L−1）和10−4 mol·L−1 Hg2+共孵育后的共聚焦显微镜图像（左）明场图像，（中）红色通道图像，（右）合并图像。

    Figure 5.  (a) The survival rate of Hela cells incubated with different concentrations of MNC; (b) Confocal laser microscope images of Hela cells incubated with MNC (10−5 mol·L−1) in the absence of Hg2+ and in the presence of Hg2+ (10−4 mol·L−1). Left: bright field; middle: red channel; right: merged image.

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    图 6  斑马鱼幼体经MNC（10−6 mol·L−1）和Hg2+（5×10−6 mol·L−1）处理后的荧光照片：（左）明场图像，（中）红色通道图像，（右）合并图像。

    Figure 6.  Fluorescence images of zebrafish larvae treated with MNC (10−6 mol·L−1) and Hg2+ (5×10−6 mol·L−1). Left: bright field; middle: red channel; right: merged image.

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-04-12
  • 刊出日期:  2021-08-27
管怡晗, 黎广进, 刘盛华, 尹军. 汞离子比色型荧光探针的合成与性质[J]. 环境化学, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
引用本文: 管怡晗, 黎广进, 刘盛华, 尹军. 汞离子比色型荧光探针的合成与性质[J]. 环境化学, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
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GUAN Yihan, LI Guangjin, LIU Shenghua, YIN Jun. Synthesis and properties of colorimetric fluorescent probe for mercury ions[J]. Environmental Chemistry, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
Citation: GUAN Yihan, LI Guangjin, LIU Shenghua, YIN Jun. Synthesis and properties of colorimetric fluorescent probe for mercury ions[J]. Environmental Chemistry, 2021, 40(8): 2544-2550. doi: 10.7524/j.issn.0254-6108.2020041201
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汞离子比色型荧光探针的合成与性质

    通讯作者: Tel：027-67867706，E-mail：yinj@mail.ccnu.edu.cn
  • 华中师范大学化学学院，农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉，430000
  • 收稿日期:  2020-04-12
  • 网络出版日期:  2021-08-03
基金项目:
国家自然科学基金（21676113，21772054），湖北省杰出青年基金（18CFA079），华中师范大学学者名师支持项目（0900-31101090002）和华中师范大学高等院校基础研究与运营优秀博士学位论文培养经费（2019YBZZ029）资助

摘要: 

汞化合物在促进工业和制造业快速发展的同时，也带来了严重的环境污染。由于其毒性极强，易于渗透，难以代谢，在生物体内富集后容易造成长期伤害。因此，开发一种能够快速、简洁、准确检测汞离子的方法具有十分重要的意义。为此，本文发展了一个基于氧硫杂冠醚配体的汞离子特异性的比色型荧光探针。该探针能够通过比色及荧光高选择性检测汞离子，且干扰性小、灵敏快捷。探针可以与汞离子形成1: 1络合物，该络合物可以在碘离子作用下将汞离子从配合物中解离，利用该平衡可以对汞离子进行定量检测。特别值得提及的是，该探针能够用于细胞及活体中汞离子的可视化检测。

English Abstract

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  • 汞化合物的应用非常广泛，它们广泛应用于化工、制药、冶金、电子仪器、军事等高新技术领域，还可用于制造科学测量仪器（如压力表、温度计等）、电子电器产品、化工产品、催化剂、汞灯、电极等。然而，由于其在工业和制造业中被大量使用，其造成的环境污染越来越严重[1-2]。与其它污染物不同的是，汞不能被生态系统本身的物理、化学或生物手段降解，而是以生物和非生物两种形式在自然界中迁移和积累。由于其毒性极强，易于渗透，难以代谢，在生物体内富集后容易造成长期伤害[3-5]。例如，汞离子可以在人体内长期存在，严重危害中枢神经系统、消化系统和肾脏等。此外，其对呼吸系统，皮肤、血液和眼睛等也有较大危害[6-7]。因此，开发一种能够快速、简洁、准确检测汞离子的方法具有十分重要的意义。

    传统的汞离子检测方法主要有原子吸收光谱法（AAS）、原子发射光谱法（AES）、电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、X-射线荧光光谱法（XRF）以及电化学方法等，这些方法具有灵敏度高、特异性好、应用广泛等优点[8-10]。但这些方法往往需要昂贵的设备，并且样品的预处理比较复杂。与传统的检测方法相比，荧光探针法不仅操作简便、检测速度快、特异性强，而且还特别适合于在细胞微环境中进行检测[11-15]。

    本文以10-苯基-1,4-二氧杂-7,13-二硫杂-10-氮杂环戊烷为汞离子检测单元、（3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基）丙二腈为荧光团，构建了一个具有红色荧光信号的比色型汞离子荧光探针，并研究了该探针对汞离子的响应以及其在生物体中的荧光成像应用。

1.   实验部分（Experimental section）

    1.1.   药品与合成

  • 除非另有说明，所有实验过程均根据标准Schlenk技术在氮气氛围下进行[16]，所有的药品和试剂均购于武汉欣申试化工科技有限公司，无需进一步纯化，溶剂使用时均经脱水处理。目标化合物经核磁氢谱和质谱表征，核磁氢谱经Bruker Mercury Plus 400 MHz核磁共振波谱仪测试完成，并以四甲基硅烷（TMS）作为化学位移值的内标，质谱经Trace 1300-ISQ质谱仪测试完成。

    • 1.2.   光谱测试

  • 将探针（1.57 mg，0.003 mmol）溶于二甲基亚砜（DMSO，3 mL）中，得到储备溶液（10−3 mol·L−1）。金属阳离子Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cd2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Hg2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Li+、Al3+分别溶解在蒸馏水中以制备浓度为10−2 mol·L−1的溶液。其中紫外-可见吸收光谱是经日立U-3310紫外分光光度计测试得到，荧光光谱是通过CARY ECLIPSE荧光光谱仪测试得到。

    • 1.3.   细胞成像

  • 在Olympus FV1000-IX81共聚焦激光扫描显微镜下获得细胞图像。其中细胞培养方法如下：在添加了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培养基中培养Hela细胞，并在含5%CO2的加湿大气中孵育。将细胞洗涤3次，然后与新鲜培养基一起孵育，用含有DMEM的血清将探针稀释至10−5 mol·L−1，并与细胞共孵育30 min。再将细胞洗涤3次，用含DMEM的血清将Hg2+稀释至10−4 mol·L−1，并与细胞共孵育30 min。

    • 1.4.   活体成像

  • 在博视精达BD-YGD-1倒置荧光显微镜下获得斑马鱼图像。其中斑马鱼的处理方法如下：购买来自南京一树梨花公司的斑马鱼鱼卵，将鱼卵在28 ℃的保温箱中孵化，并及时补充水，孵化后无需添加饲料并继续养3 d后直接使用。

    • 1.5.   虾样品预处理

  • 称取虾肉0.5 g于5 mL浓硝酸中后在60 ℃下酸解过夜。酸解结束后80 ℃加热至完全溶解，减压蒸馏除去所有溶剂。分次用蒸馏水将硝解液残渣溶解、离心，收集上层清液后用NaOH溶液调至pH = 7.4，将体积定容至150 mL得到预处理的虾样品溶液。

    • 1.6.   探针的合成与表征

  • 探针的合成方法如图1所示，首先根据文献方法合成具有汞离子识别功能的单元NTO[17-19]，将其与（3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基）丙二腈以1∶1溶解在乙腈中，加入少量哌啶。回流反应5 h，待溶液变成血红色后停止加热。经旋转蒸发仪除去溶剂，通过柱层析纯化（PE:DCM = 1:2），以较高收率得到具有红色荧光的目标探针MNC。其结构通过核磁共振和电喷雾质谱进行了表征。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ =7.38−7.40 (d, 2H, Ar-H), 7.68−7.02 (d, 1H, =CH), 6.81 (s, 1H, =CH), 6.75 (d, 1H, =CH), 6.62−6.64 (d, 2H, Ar-H), 3.82 (t, 4H, -CH2), 3.65−3.71 (m, 8H, -CH2),2.91 (t, 4H, -CH2), 2.77(t, 4H, -CH2), 2.57 (s, 2H, -CH2), 2.45 (s, 2H, -CH2), 1.07 (s, 6H, -CH3). ESI MS (m/z):calcd. for C29H37N3O2S2, 523.23; found 524.15 [M+H]+。

2.   结果与讨论(Results and discussion)

    2.1.   探针检测

  • 首先利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了探针MNC在DMSO-H2O（V/V = 5:95）溶液中对各种金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cd2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Hg2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Li+、Al3+的选择性。如图2所示，探针MNC的紫外吸收和荧光发射分别位于520 nm和672 nm处。加入Hg2+后，紫外吸收光谱和荧光光谱发生明显改变。最大吸收波长从520 nm处蓝移至400 nm处（图2a），溶液颜色从红色转变成黄色（图2b）。在荧光光谱中，672 nm处的荧光发射峰明显减弱（图2c）。特别值得提及的是，当加入其它金属离子时，溶液的颜色和荧光变化较小。这一系列实验结果表明，该探针不仅能够通过颜色变化高选择性识别Hg2+，而且还可以通过荧光变化特异性检测Hg2+。此外，探针在较宽pH范围内（3.0 — 10.0）均具有高选择性（图2d）。通过计算拟合发现，探针MNC和Hg2+的络合比为1∶1，结合常数ka = 1.6×105 （mol·L−1）−1，检测限DL为8.33×10−5 mol·L−1。

    为了进一步探究探针MNC对Hg2+的响应，研究了探针MNC在DMSO-H2O（V/V = 5:95）溶液中加入不同浓度Hg2+（0 — 7×10−5 mol·L−1）后的紫外-可见吸收光谱与荧光光谱。在紫外吸收光谱（图3a）中，随着Hg2+的加入，探针MNC在520 nm的吸收峰逐渐减弱，同时在400 nm处的吸收峰逐渐增强，等吸收点出现在447 nm处。在荧光光谱（图3b）中，Hg2+的加入会导致MNC在672 nm的荧光强度逐渐减弱。在一定范围内探针MNC的最大发射峰强度和Hg2+浓度（3×10−5 — 6×10−5 mol·L−1）之间呈现出良好的线性相关关系（R2 = 0.9966）（图3c、d），表明探针MNC具有定量检测Hg2 +浓度的潜力。

    利用碘离子（I−）研究了探针MNC（10−5 mol·L−1）与Hg2+（2×10−4 mol·L−1）之间的络合与解离。研究结果显示，随着KI的加入，络合物MNC-Hg的紫外-可见吸收光谱在400 nm的吸收峰逐渐减弱，并伴随着520 nm处的吸收峰逐渐增强（图4a）。在荧光光谱中，672 nm处的荧光强度随着KI的加入（0 — 1.1×10−4 mol·L−1）逐渐增强（图4b、c）。结果表明，探针MNC对Hg2+的络合能够在I−离子存在下发生可逆的络合与解离，该可逆过程为的Hg2+定量检测提供了一个合适的方法。值得注意的是，KI的浓度在一定范围内（3×10−5 — 8×10−5 mol·L−1）与络合物MNC-Hg的荧光强度呈现良好的线性关系（R2 = 0.9892）（图4d），进一步表明该探针能够用于Hg2+的定量检测。

    • 2.2.   细胞成像

  • 探针MNC表现出了良好的Hg2+检测能力，随后考察了探针MNC在细胞中检测Hg2+的可行性。首先，采用MTT实验验证了探针的细胞毒性。采用不同浓度的探针与Hela细胞共孵化2 h，观察细胞存活情况（图5a），结果显示在MNC浓度为2.5×10−6、5×10−6、10−5、2.5×10−5、5×10−5、10−4 mol·L−1 的环境中细胞存活率都接近100%，表明探针MNC的细胞毒性极低。随后，利用探针MNC对Hela细胞中的Hg2+进行荧光成像。在激光共聚焦显微镜（LSCM）下，探针MNC在Hela细胞中显示出红色荧光，与Hg2+孵育后红色荧光减弱（图5b），表明探针MNC可以用于细胞中Hg2+的可视化检测。

    • 2.3.   活体成像

  • 随后，进一步探索了该探针在斑马鱼活体中对Hg2+的检测能力。将斑马鱼幼体用探针MNC（10−6 mol·L−1）共培养1 h后，用蒸馏水洗去浮色后置于倒置荧光显微镜下观察。可以发现斑马鱼幼体的眼睛和腹部有明亮的红色荧光（图6a— c），表明探针MNC能够在活体水平上进行成像。进一步将以上斑马鱼与Hg2+（5×10−6 mol·L−1）共培养20 min后，再置于显微镜下观察发现，与仅用探针培养的斑马鱼相比，Hg2+处理过的斑马鱼幼体内的荧光强度明显减弱（图6d — f），这是由于斑马鱼体内的探针MNC与汞离子络合所致。这些研究结果表明，探针MNC可以用于斑马鱼体内检测Hg2+。

    • 2.4.   虾样品中Hg2+检测

  • 鉴于探针MNC具备定量检测Hg2+的能力，随后将其应用于虾样品中Hg2+含量的测定。将预处理后的样品与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）按照体积比95:5混合，加入不同浓度的Hg2+，再加入探针MNC（10−5 mol·L−1）混合均匀后，测量其荧光光谱。结果显示，探针MNC的荧光强度与Hg2+浓度呈较好的线性关系（R2 = 0.9818）。通过拟合计算出回收率在82.87% — 122.25%之间，相对标准偏差（RSD）小于13.3%，相对误差小于22.25%。虽然存在一定的误差，但Hg2+的添加量与实测值基本一致，表明探针MNC可以用于虾中Hg2+含量的初步定量分析。

3.   结论（Conclusion）

  • 本文介绍了一例新的比色型Hg2+荧光探针，它由含有苯甲醛基的氧硫杂冠醚和具有红光发射的（3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基）丙二腈组成，该探针能够高选择性检测Hg2+，且荧光强度与Hg2+浓度呈现良好的线性相关，能够用于虾样品中Hg2+的定量检测分析。特别值得提及的是，该探针还可以用于活细胞与斑马鱼中Hg2+的可视化检测。下一步的研究将集中在将该探针用于更多实际样品中Hg2+的检测，建立定量检测分析平台。

参考文献 (19)

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