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量子点（quantum dots，QDs）作为新型纳米材料，在基因组学，蛋白质组学和高通量筛选等研究中均有很好的应用前景[1-3]，同时在半导体产业和光电子器件方面影响巨大，目前部分产业如量子点电视已量化生产且投放市场[4]。随着量子点生产和应用规模不断扩大，大量QDs在生产和应用过程中被释放到环境中，对环境和人体健康造成不利影响，但其生态健康风险及相关环境行为并未完全探明。
硒化镉量子点（CdSe QDs）比较稳定、不易降解[1]，具有致癌性。研究发现，QDs可通过皮肤和黏膜被动物和人体吸收，对人成纤维上皮细胞和皮肤细胞均表现出一定的毒性效应[5-6]。对斑马鱼胚胎的暴露研究发现，QDs影响斑马鱼胚胎的形态发育、氧化应激和应激蛋白的基因表达[7]。铜绿假单胞细菌（Pseudomonas aeruginosa）中积累的硒化镉量子点可通过食物链传递到其捕食者原生动物——嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）中，并存在生物放大现象[8]，还有研究显示在量子点保护性外层包被的存在下，随食物链的转移使初级消费者的摄入量增加，从而造成更高营养水平生物的暴露和损伤的风险增加[9]。对拟南芥进行硒化镉量子点暴露研究，虽没有观察到硒化镉量子点的内化，但观察到植物体产生了明显的氧化应激反应[10]。
Klaine等[11]认为纳米材料在土壤和水生态系统中的环境行为研究十分重要，特别需要开展纳米材料对于这些生态系统中栖息的生物效应的研究。小球藻作为水生态系统的初级生产者，外源污染物对它的影响会直接影响食物链的物质传递和能量传递，进而影响高营养级生物[12]，因此，以小球藻为代表的藻类微生物，其种群发展对整个生态系统的平衡和稳定具有重要影响[13]。另外，小球藻对外源污染物较为敏感，是生态毒理学研究中的重要模式生物[14-15]，常被用于评估环境污染物毒性、水环境安全等[16-17]，在纳米材料[13, 17-23]、抗生素[12]、重金属[14]、有机污染物[24]等的毒性研究中都有广泛应用。
本研究重点关注了硒化镉量子点与普通小球藻（Chlorella vulgaris）的相互作用，研究硒化镉量子点在环境中的迁移转化，揭示其对水生微生物的毒性效应，阐释潜在生态环境与健康风险。
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硒化镉量子点CdSe（ZnS-CA QDs）购于苏州星烁纳米科技有限公司，光致发光波长（photoluminescence emission，简写PL Emission）为621 nm，半峰全宽（Full width at half maximum，简写FWHM）为24 nm，荧光量子产率（quantum yield，简写QY）为45%。标准样品保存于4 ℃黑暗条件。
普通小球藻Chlorella vulgaris（FACHB-8），购于中科院水生生物研究所淡水藻种库，培养于灭菌的BG11培养基中。小球藻的培养和暴露均在光照恒温箱（PAX-1000C，中国）内进行，条件设置为：光照强度22000 LX下照射16 h，温度约为28 ℃，黑暗8 h，温度约为25 ℃，每天人工振荡若干次。
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移取适量普通小球藻置于250 mL锥形瓶内，使用流式细胞仪测定细胞个数[25]并保证小球藻的初始生物量为2.5×105 cell·mL−1，在小球藻溶液中加入适量量子点材料后用BG11培养基定容至150 mL。量子点暴露浓度设置为：0（阴性对照组，含有小球藻，不含量子点）、0.2、1、5、10、20 nmol·L−1，每个浓度组设置3个平行（n=3）。另准备以超纯水配置的各实验浓度的量子点溶液（不含有小球藻，只含有量子点）和既不含藻也不含量子点的超纯水分别作空白组1（n=3）和空白组2（n=3），这两个空白组均被用于酶标仪空白的测定，结果显示这两组空白对照的酶标仪测定结果无显著差异，所以后续分析中直接以纯水用于酶标仪空白值的测定，并在细胞数测定中对测定值进行扣除空白处理。暴露组和对照组均培养于光照培养箱内，在暴露的各时间点对暴露体系和阴性对照组进行取样分析，分别测定培养基中总Cd浓度、细胞数和各生化指标、并用显微镜观察细胞形态。由于设置的暴露浓度中，较低的暴露浓度组（0.2 nmol·L−1和1 nmol·L−1）与较高的暴露浓度组（5、10、20 nmol·L−1）结果存在较大差异，因此后面的讨论中将0.2 nmol·L−1和1 nmol·L−1浓度组称为低浓度组，将5、10、20 nmol·L−1的浓度组称为高浓度组。
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在暴露的第1、2、4 d对培养基中Cd浓度进行取样测定，并在低浓度组实验中为了进一步观察短时间内的暴露效应变化，增加了4 h这一取样时间点。取样后过滤去除藻细胞，测定经过藻细胞吸收/吸附、代谢量子点后培养基溶液中剩余的量子点含量，具体操作如下：用注射器吸取2 mL暴露瓶中的藻液，经0.2 µm PES滤膜针头过滤器进行过滤，收集滤液于10 mL离心管，加入0.5 mL浓硝酸后用超纯水稀释定容至10 mL。最终稀释Cd浓度至500 µg·g−1以下，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，Agilent 8800，USA）测定Cd的浓度。
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在暴露后6 h和1、2、4 d对细胞数进行取样测定。不同浓度（即细胞数不同）藻液各取200 µL，用流式细胞仪慢速测定其单位体积细胞数。用酶标仪（Thermo Scientific，VARIOSKAN FLASH）测量这些小球藻液在680 nm处的光密度值[26]，以去除空白后的光密度为x轴，以单位体积细胞数为y轴作图，得到单位体积细胞数和光密度的标准曲线线性方程为：
y=234.72x+3.2782 （R²=0.9901 ），据此可以计算暴露过程中暴露组和对照组中的藻细胞数变化。具体操作为：按时间间隔对暴露体系和对照组进行取样，测定藻液样品在680 nm处的光密度值，扣除空白后代入以上标准曲线得到细胞数。 -
在暴露后4 h和1、2、4 d对各生化指标进行取样测定。根据Yu等[27]和Liu等[28]的方法，使用荧光素二乙酸盐（fluorescein diacetate，FDA）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、罗丹明123（rhodamine 123，Rh123）、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA）分别对普通小球藻进行染色，避光孵育后测定其荧光信号，可分别反映小球藻细胞酯酶活性、细胞膜完整性、线粒体膜电位、细胞内活性氧（ROS）含量。具体操作为：取1 mL藻液，加入适量染色试剂（工作溶液1 mmol·L−1），室温铝箔纸包裹避光孵育一定时间后，进行离心（4500 r·min−1，10 min），弃去上清液，收集的藻细胞中加入1 mL磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），重悬浮后再次离心（4500 r·min−1，10 min），弃去上清液。加入200 µL PBS重悬浮后用流式细胞仪（ACCURI C6，BD，USA）检测对应通道的荧光值（表1）。各染色剂用量、避光孵育时间和对应荧光通道如表1所示。叶绿素的测量无需添加外源染色试剂，样品经过两次离心清洗、重悬浮即可用流式细胞仪检测FL3通道的荧光值。
应用流式细胞仪测定染色后藻细胞的荧光响应，采用中速进样方式，采集10000个细胞信号，得到旁散射（SSC）-前散射（FSC）图，其中SSC可反映细胞/颗粒的内部复杂程度，FSC可反映细胞/颗粒的体积大小。以SSC和FSC为依据，确定其中符合活细胞特征的信号，分析其对应通道的荧光强度。以相对荧光强度（无量纲）表示指标测试水平。
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通过光学显微镜，对小球藻细胞形态进行观察：直接吸取暴露4 d后的藻液滴到载玻片上，在400倍的放大倍数下进行观察。
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本研究中所有数据呈现为平均值±标准偏差，暴露组和阴性对照组之间数据差异的显著性用SPSS软件的单因素方差分析进行统计分析。其中*表示P<0.05，具有显著差异；**表示P<0.01，具有极显著差异。
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小球藻暴露QDs后，藻细胞的生长和增殖均会受到一定的影响，对于小球藻细胞增殖的变化可以用比生长速率（μ）进行评估，其计算公式如下[29]：
其中，Nx表示暴露x时刻的细胞数，Ny表示暴露y时刻的细胞数，tn表示从暴露x时刻到y时刻的天数。
为避免在没有QDs干扰的生长条件下，小球藻细胞正常增殖过程对于QDs效应评估的影响，利用阴性对照组（0 nmol·L−1）的平均比生长速率对QDs暴露组的比生长速率进行了归一化处理，得到相对比生长速率（μ，无量纲），公式如下：
利用上述公式计算得到量子点暴露各时间段内（6 h至1 d、1至2 d、2 d至4 d）小球藻的相对比生长速率。如图1所示，6 h至1 d、1至2 d、2 d至4 d的3个时间段内，除了0.2 nmol·L−1暴露组相对比生长速率在接近0 nmol·L−1组数值的范围内波动外，其他暴露组的相对比生长速率均小于阴性对照组，有的组别的相对比生长速率还出现负值的情况，表明在暴露期间，1、5、10、20 nmol·L−1暴露组中小球藻的细胞增殖均低于阴性对照组，有的甚而出现负增长，即有可能出现了藻细胞的死亡。6 h至1 d的时间段内，1、5、10、20 nmol·L−1暴露组的相对比生长速率在整个测试时间段内最低，表明小球藻对量子点的毒性响应非常迅速且灵敏，而暴露浓度越大，小球藻的相对比生长速率越小，这种差异性在暴露初期最大。1—2 d内各浓度暴露组的相对比生长率均有明显的抬升，表明暴露一段时间之后，小球藻对量子点的毒性有了一定的耐受能力，从而生长增殖活性有所回升；2—4 d数据显示各浓度暴露组的相对比生长速率趋于稳定，但均小于阴性对照组（0 nmol·L−1）。在量子点胁迫下，1、5、10、20 nmol·L−1小球藻细胞数在暴露初期显著低于对照组，在后期有所回升，表明受到胁迫后还能够存活的抗逆性强的藻细胞在适应了外界胁迫后又继续生长繁殖，但其生长速率还是低于阴性对照组。而浓度最低的0.2 nmol·L−1暴露组虽然受影响最小，但仍表现出一定的抑制作用。
用比生长速率的半数效应浓度（EC50）进一步评估小球藻生长受到的抑制。EC50指能引起50%最大效应的浓度，即根据抑制率与浓度的关系，计算目标化合物对藻类生长抑制率为对照的50%时的作用浓度[30]。抑制率（I）根据比生长速率计算，公式如下[31]：
其中，μ0表示阴性对照组的平均比生长速率，μz表示各暴露处理组的比生长速率。
经计算96 h（4 d）后各处理组对小球藻生长的抑制率如表2所示，结果表明不同浓度的量子点在暴露总时长内（4 d）对小球藻的生长均表现出抑制效应。纳米材料对小球藻生长抑制的剂量-效应关系曲线多呈 S 型[32-33]，本实验的数据同样符合S型曲线特征。利用origin软件中的Growth/Sigmoidal函数组中的Hill函数拟合CdSe(ZnS-CA QDs)对小球藻生长抑制率曲线，得到EC50（4 d）为0.70 nmol·L−1。本实验选择的暴露浓度5、10、20 nmol·L−1均远大于EC50（4 d），致使小球藻生长受到明显抑制，生长抑制率均大于70%（表2）。
进一步用光学显微镜对暴露4 d的藻细胞进行形态学观察，发现0.2 nmol·L−1暴露组的小球藻细胞形态、数量与阴性对照组（0 nmol·L−1）差异不大（图2）。而1、5、10、20 nmol·L−1暴露组的小球藻细胞均明显较对照组细胞数量少，且有细胞体积增大、甚至细胞破裂、胞质溢出的情况，与相对比生长速率的结果一致。由此可见，量子点暴露会改变细胞形态，促使细胞膨大破裂。
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测定了去除了藻细胞后的培养基溶液中Cd的量，即藻细胞对量子点吸收/吸附后剩余在溶液中的量，以暴露Cd的初始总量扣除培养基溶液中Cd的含量，即可计算藻细胞对量子点的吸收/吸附量（图3），再除以暴露Cd总量可得到小球藻对量子点的吸收/吸附率（表3）。对于活跃的藻细胞而言，同时存在对外源污染物的吸收和吸附，但二者在本研究中未能加以区分。如图3和表3所示，0.2 nmol·L−1和1 nmol·L−1暴露组小球藻对量子点的吸收/吸附在暴露后呈先上升后下降的趋势，暴露开始时吸附/吸收量迅速增加，1 d后吸收/吸附量下降，在2 d后趋于稳定（2 d与4 d的Cd吸收/吸附浓度没有显著差异）。这一时间变化趋势表明Cd能够迅速被小球藻吸附/吸收，之后存在量子点吸附后解吸或者吸收后又外排的情况。5、10、20 nmol·L−1暴露组中小球藻细胞生长受到严重抑制，出现大量死亡破碎的现象（图2），使活细胞的吸收过程非常有限，而死细胞或细胞残体对QDs的吸附作用成为主导，这种吸附作用也是在1 d后基本达到平衡。有研究显示，某些藻类的死细胞对重金属的吸附性能甚至强于活细胞[34]，死亡细胞因细胞壁、细胞膜破裂，有更多官能团外露，所以虽然细胞死亡后主动转运等富集机制失效，但细胞对金属的吸附能力反而增强[35]。因此即便小球藻细胞增殖受到影响和抑制，甚而在高浓度下发生死亡，但在本研究的暴露浓度范围内，随着暴露浓度的增加，小球藻对量子点的吸收/吸附率还是呈现出随暴露浓度上升而上升的趋势（表3）。
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荧光素二乙酸盐（FDA）能被活细胞摄取，并在细胞内被酯酶转化为荧光产物，因此FDA处理后小球藻的荧光值可反映其酯酶活性[36]，且酯酶活性在毒理学中是比较敏感的指标，酯酶活性越高，新陈代谢越活跃[37]。阴性对照组（0 nmol·L−1）藻细胞的酯酶活性，即代谢强度在研究期间（4 d内）呈现先上升后下降的趋势，这与细胞的生长周期有关，初期，细胞进入指数增长期，细胞活性增强，代谢随之加强；到第4天时，随着培养基的消耗和藻细胞的增殖与竞争，细胞新陈代谢强度下降。为了排除细胞自然生长过程中酯酶活性变化对量子点效应的影响，将量子点对酯酶活性的影响对阴性对照组进行了归一化处理，得到的酯酶活性变化如图4所示。
0.2 nmol·L−1和1 nmol·L−1的低剂量暴露组与5、10、20 nmol·L−1的高剂量暴露组在暴露初期（4 h）对小球藻酯酶活性的影响具有明显差异，受到低剂量量子点胁迫后，酯酶活性显著低于阴性对照组。然而，高剂量暴露组的酯酶活性则高于对照组，特别是20 nmol·L−1的暴露组，酯酶活性显著高于对照组。这种藻细胞经受高剂量量子点胁迫时新陈代谢显著增强的现象一方面可能是小球藻对外界胁迫所采取的应激和修复策略，从而抵抗量子点暴露带来的毒害，有文献发现藻类细胞通过增加代谢活性来实现酶、化合物的合成以及维持基因表达[38]。另一方面也可能是受到严重的毒害作用后，细胞代谢功能紊乱造成的[26]。1 d后，0.2 nmol·L−1暴露组酯酶活性有较大程度的恢复，趋近于对照组，这与前文中细胞数的检测结果相符，适应了暴露环境后藻细胞恢复了一定的数量，藻细胞整体代谢活性也有所上升。但因量子点暴露使小球藻受到一定程度的毒害，新陈代谢活性整体还是略低于对照组。而1、5、10、20 nmol·L−1暴露组中藻细胞的酯酶活性在1 d后均呈现出显著下降，远低于0 nmol·L−1阴性对照组，表明藻细胞新陈代谢已变得极其微弱，几乎都处于衰亡阶段。
量子点对小球藻酯酶活性的半数效应浓度同样可以用抑制率来表征[39]，同小球藻生长抑制率的计算方法（式4），其中，μ0表示阴性对照组的相对荧光强度，μz表示各暴露处理的相对荧光强度，得到暴露24 h（1 d）时量子点对小球藻酯酶活性的抑制率（Iea）。用此抑制率对量子点暴露浓度做折线图，采用直线内插法[40-41]得到量子点暴露对小球藻酯酶活性抑制效果的半数效应浓度（EC50ea）为0.55 nmol·L−1.
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细胞膜是细胞与外界进行物质交换的直接通道，同时也是细胞抵御外界侵扰的一道防线[28]。藻类在污染物暴露下，由毒性胁迫导致的细胞膜损伤经常被用作衡量毒性效应的指标[26, 42-43]。正常情况下，染色剂碘化丙啶（PI）无法进入细胞内，但当细胞膜出现损坏时，PI即可进入细胞内，并使核酸染色，测定核酸染色的荧光水平即可反映普通小球藻的细胞膜完整性[44]，因此测得的荧光水平越高，细胞膜完整性越低。本实验用暴露组与对照组的相对荧光强度来表征细胞膜的完整性，如图5所示。0.2 nmol·L−1暴露组小球藻的细胞膜完整性在暴露期间内与阴性对照组相近，表明该暴露浓度对小球藻细胞膜的影响不大。1 nmol·L−1组在暴露初期（4 h）与阴性对照组相近，对细胞膜完整性的影响还不显著，但在1 d后细胞膜完整性比对照组有明显降低，表明该暴露浓度下，量子点对小球藻的细胞膜已经具有较为明显的损坏作用。高浓度暴露组（5—20 nmol·L−1）细胞膜的完整性在暴露1 d至2 d内显著低于对照组，且与暴露浓度呈负相关。即暴露浓度越高，毒性作用越大，细胞膜完整性越低。由于细胞膜完整性不佳的细胞首先被致死，因此4 h时高浓度暴露组细胞膜完整性为5 nmol·L−1组>10 nmol·L−1组>20 nmol·L−1组。而在暴露的最后（4 d），用于表征细胞膜完整性的相对荧光强度值对1—20 nmol·L−1暴露组都有所下降，则是因为在该时间点这些暴露组的荧光强度测得值与2 d的测定值相近，但对对照组而言，由于培养基的消耗和藻细胞的增殖与竞争致使其细胞膜完整性下降，即计算相对荧光强度时，分母增大，从而使该时间点的相对荧光强度降低。
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罗丹明123（Rh123）是一种线粒体跨膜阳离子荧光染剂，正常功能的线粒体能使其留在线粒体基质内，进而使其荧光消失或减弱，但当线粒体膜完整性受损时，Rh123会通过转运孔从线粒体内释放，发出黄绿色荧光[45]。所以Rh123染色荧光值可反映普通小球藻的线粒体膜电位的高低，荧光值越高，线粒体膜电位越高。线粒体作为细胞中具高负电性的膜系统，80%以上的ATP是由线粒体合成的，其膜电位变化可反映细胞的生理状态[45]。如图6所示，0.2 nmol·L−1组线粒体膜电位时间变化趋势与阴性对照组相近，该暴露浓度对线粒体膜电位没有显著影响。1—20 nmol·L−1暴露组线粒体膜电位在4 h时均与对照组持平，表明线粒体功能在暴露初期（4 h内）未受到明显影响，但1 d后线粒体膜电位均明显高于对照组，表明藻细胞因量子点的毒性引起应激反应，随着暴露时间的增长，所受的毒害逐渐超过细胞自身的调节能力，线粒体功能发生紊乱，ATP所主导的能量代谢受阻或停滞。相似的现象在金属离子对假单胞菌的毒性胁迫[43]以及全氟磺酸和全氟羧酸对淡水藻膜的影响[28]中都有报道。
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活性氧（ROS）会在正常细胞代谢中产生，并有抗氧化系统不断去除ROS，使生物体内的ROS始终保持一种动态平衡。但在受到胁迫时，ROS会增多，超过细胞本身能去除的水平，导致细胞受损[46]。2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）在穿透细胞后易脱掉乙酰基转为活性形式，然后被ROS氧化形成荧光，可反映普通小球藻细胞内ROS含量[47]，荧光值越高，胞内活性氧含量越高，氧化应激反应越严重。图7显示0.2 nmol·L−1暴露组在4 h至2 d内与阴性对照组小球藻的氧化应激没有显著差异，但在暴露4 d时，胞内ROS水平显著高于阴性对照组，推测0.2 nmol·L−1暴露组的小球藻除了增殖引起的轻微胁迫，还经受了量子点的毒害，致使其胞内ROS含量激增。1—20 nmol·L−1暴露组细胞内ROS含量在4 h时显著高于对照组，表明细胞出现严重的氧化应激反应，而ROS过多会导致酶的失活和DNA损伤，进而导致细胞受损，甚至死亡。1 d后这几个暴露组藻细胞内ROS含量逐渐降低，甚至低于对照组，推测一方面由于藻细胞在量子点毒害作用下破损致死，使其无法进行正常应激反应，另一方面对照细胞增殖导致的轻微胁迫，使胞内ROS上升，导致表征结果值（即相对荧光强度）下降。Morelli等研究也发现在海水中CdSe/ZnS QD暴露导致硅藻ROS增加[48]。这一结果也在一定程度上解释了藻细胞凋亡受损的分子机制。
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小球藻作为光合自养生物，会产生多种吸收可见光的色素。这些色素在光合作用中捕获光子的同时，会有一部分能量以荧光的形式放出。小球藻的主要色素是叶绿素a和叶绿素b，其中叶绿素a荧光峰值在676 nm[49]，FL3通道能检测叶绿素a的荧光强度[39-40]。叶绿素荧光强度能反映小球藻叶绿素含量，进而反映光合作用情况。图8显示0.2 nmol·L−1组叶绿素含量在暴露期间与对照组相近。
1、5、10、20 nmol·L−1组叶绿素含量在4 h时与对照组相近，说明叶绿体功能在暴露初期（4 h内）未受到明显影响。高浓度组在1 d后叶绿素含量持续下降，极显著低于阴性对照组，这可能与量子点的毒害作用使叶绿体受创程度随着时间的延长而加重有关，叶绿体功能紊乱，致使叶绿素含量下降。Ouyang等[50]发现氧化石墨烯暴露会抑制普通小球藻的叶绿素a合成，并且通过代谢组学证明其抑制作用可能与叶绿素a的前体丝氨酸的减少有关。Zhang等[51]发现碳量子点暴露降低了小球藻二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）活性并抑制了光合相关基因的转录。叶绿素a含量减少也可能与量子点在细胞表面的吸附有关，Oukarroum等[52]研究发现，氧化镍纳米粒子（NiO-NPs）暴露时，NiO-NPs会在藻类细胞表面吸附聚集，将藻细胞包围，从而导致光合作用所需的光和营养物质的有效性降低。1 nmol·L−1组在1 d至2 d内同样叶绿素含量下降明显，但4 d时，叶绿素含量有所回升，这与细胞数的检测结果相符，随着藻细胞的恢复，藻细胞整体光合作用有所回升。量子点对小球藻光合作用的半数效应浓度同样可以用抑制率来表征[39]，计算方法同上，结果显示，暴露24 h（1 d）时量子点抑制小球藻光合作用的半数效应浓度（EC50p）为0.70 nmol·L−1。
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从各生化指标和细胞数量、形态的检测可以看出，高浓度暴露组间各指标差异不明显，主要是由于暴露浓度超出了小球藻能承受的浓度范围，致使大量细胞死亡，无法观测生化指标的时间变化。但在低浓度组中，可以明显观测到普通小球藻在量子点胁迫下的剂量-效应关系，CdSe(ZnS-CA QDs)对小球藻新陈代谢、细胞膜、线粒体、叶绿体均有不同程度的毒害，导致藻细胞的膜系统，随暴露时间延长和暴露浓度的增加毒性效应增强。这与其他文献报道的硒化镉量子点对蛋白核小球藻的膜系统有着明显的破坏作用是一致的[53]。且不同检测指标对毒性的响应速度不同，暴露24 h（1 d）的EC50ea和EC50p分别为0.55 nmol·L−1和0.70 nmol·L−1，表明酯酶活性和光合作用这两项检测指标在暴露早期就表现出高敏感性，且酯酶活性表现出更高的敏感性，但对于细胞生长的抑制情况则要到暴露96 h（4 d）才能显露；线粒体膜电位和叶绿素含量在暴露4 h时响应并不明显，显著的毒性效应出现在暴露1 d后，而其他的生化指标则在暴露初期（4 h）就有明显毒性效应，这表明硒化镉量子点首先对细胞膜、细胞质内无膜包被的系统和代谢产生影响，然后进一步影响胞内相对独立的细胞器。
本文所选取的硒化镉量子点对小球藻的毒性明显大于Yan等[53]文献中报道的毒性。推测这主要与研究的量子点和植物种类不同有关。Yan等[53]使用的是蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）和巯基乙酸（TGA）包被的CdSe QDs；而本研究选用的是普通小球藻（Chlorella vulgaris）和巯基乙胺（CA）包被的CdSe QDs。除不同种类小球藻对量子点耐受性的差异外，更大的可能是CdSe QDs包被材料的不同所带来的毒性差异。巯基乙酸（TGA）包被膜材料呈酸性，使量子点带负电；而巯基乙胺（CA）包被材料呈碱性，使量子点带正电。研究发现表面带正电的纳米材料更容易引发毒性效应[15]，同时也有研究显示[54]，植物根系对带电不同的污染物存在差异吸收，这种情况也很可能发生在藻细胞上。小球藻表面因存在磷酸基团和羧基而带负电，对阳离子有更强的吸附作用[55-56]因此带正电的CdSe（ZnS-CA QDs）更容易被小球藻吸附和吸收，进入细胞内，破坏细胞的选择透性，从而进一步扩大进入细胞的外来污染物数量，导致蛋白质变性，酶失活，最终导致细胞死亡。所以带正电的巯基乙胺（CA）包被的硒化镉量子点比巯基乙酸（TGA）包被的CdSe毒性更强，其所带来的生态与健康风险也更高。
此外，研究结果还显示在较低的浓度水平下，1 nmol·L−1硒化镉量子点即可使小球藻群体生物量增长停滞，进而导致整个生态系统的物质能量循环出现问题。若水生态系统内以小球藻为代表的生产者们难以为继，不充足的能量物质转化将会使更高营养级的生物难以生存，生态系统的物质循环和能量传递平衡被打破，将导致生态系统内种群数量减少和生物多样性退化，最终使环境恶化甚至崩坏。
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本论文研究了CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻生长和生化指标的影响，发现该硒化镉量子点表面带有正电荷，能被表面带负电的小球藻吸附/吸收，从而使小球藻的新陈代谢受到干扰，细胞膜破碎，线粒体产能下降、氧化应激加剧。该材料在极低水平（1 nmol·L−1）即可对小球藻生长繁殖造成巨大影响，进而可能影响整个生态系统的物质能量循环。本研究为纳米材料对小球藻的毒性研究提供了一些初步的基础数据，也为进一步深入研究水体环境中硒化镉量子点的生态毒理效应奠定了基础。
硒化镉量子点对普通小球藻生长和生化指标的影响
Toxic effects of cadmium selenide quantum dots CdSe (ZnS-CA QDs) on the growth and biochemical indices of Chlorella vulgaris
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摘要: 新型纳米材料——量子点在基因组学、蛋白质组学、高通量筛选以及半导体等方面应用十分广泛，但人们对其生物毒性效应和生态环境风险的了解并不充分。本文研究了硒化镉量子点CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻生长和生化指标的影响，对细胞数、酯酶活性、细胞膜完整性、线粒体膜电位、细胞内活性氧含量及培养基内量子点含量及其随时间的变化趋势进行了测定，表征了量子点的毒性效应。发现硒化镉量子点表面带有正电荷，能被小球藻（因表面存在磷酸和羧基基团而带负电）吸附/吸收，从而使小球藻的新陈代谢受到干扰，细胞膜破碎，线粒体产能下降，氧化应激加剧，叶绿素含量下降。该材料在极低水平（1 nmol·L−1）即可对小球藻生长繁殖造成巨大影响，进而可能影响整个生态系统的物质循环和能量流动。Abstract: Nanomaterials—quantum dots are widely used in various areas, including genomics, proteomics, high throughput screening and semiconductors. Their environmental and ecological risks are not fully understood. In this paper, the toxic effects of cadmium selenide quantum dots CdSe (ZnS-CA QDs) on Chlorella vulgaris were studied. The cell growth, esterase activity, cell membrane integrity, mitochondrial membrane potential, intracellular reactive oxygen and variation of cadmium concentration over time were systematically evaluated. It was found that the positively charged CdSe(ZnS-CA) QDs could be adsorbed/absorbed by chlorella. It could possibly be attributed to the negatively charged cell wall for the presence of phosphate and carboxyl groups on cell surface. QDs interfered with the metabolism of chlorella, damaged the cell membrane, declined the mitochondrial productivity, intensified the oxidative stress and reduced chlorophyll content. The QDs had intensively adverse impacts on the growth and reproduction of chlorella at very low levels (1 nmol·L−1), which may further influence the material circulation and the energy flow of the entire ecosystem.
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Key words:
- Chlorella vulgaris /
- novel nanoparticle material /
- toxic effects /
- impact assessment
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再生水厂的除臭问题不容忽视。传统的除臭方式分为物化法及生化法[1]。物化法主要包括活性炭、化学除臭、等离子除臭和臭氧氧化除臭[2-3]。活性炭法灵活迅速，但对活性炭的消耗量大；化学法适合处理高浓度臭气，然而药剂的使用不具有生态可持续性；等离子和臭氧氧化设备操作简单，但需要建设高压脉冲放电设施。生化除臭法是利用生物对臭气进行吸附转化，主要包括生物滤池、生物滴滤塔和生物滤床[4-5]，虽较物化的处理方式更加绿色，然而上述处理方式均需封闭恶臭单元，占地面积大、动力消耗高、建设和运行费用高[6]。全过程除臭是近几年兴起的一种除臭方法，其关键设备是一台置于生化池中的除臭培养箱。利用培养箱中的填料富集并驯化污水中的脱氮、除磷、脱硫优势微生物，使其随回流污泥充斥于整个系统内并长效增殖[7]，以实现对各个工艺环节的NH3和H2S的全过程高效脱除。同时，位于箱底的曝气头可推动水流，强化气-液-固三相传质，从而在源头上削减臭气[8]。全过程除臭技术通过调控整个污水系统里的微生物而达到减臭除臭目的，使用的设备结构简单、安装方便、运行稳定、投资成本低、运行能耗少[9]，是一种高效低碳的技术。
冯辉等[10]在天津市张贵庄污水处理厂的设计中采用了全过程除臭工艺，对厂区周界下风向无组织排放恶臭、氨、硫化氢进行了检测，其最大浓度均达到了天津市地方标准《恶臭污染物排放标准》 (DB12/-059-95) 。薛二军等[11]发现，采用全过程除臭工艺后，污水厂粗细格栅的H2S质量浓度由原工艺的180 mg·m−3 降至30 mg·m−3以下。然而，针对全过程除臭工艺，若构筑物中臭气监测点位少及污染物检测的种类少，则无法准确表征污水处理过程中臭气的排放规律和强度，易造成臭气的主成分和关键污染点位识别不准确的问题，故需要对多构筑物中的多种气相污染物进行监测。此外，再生水厂的臭气来源于微生物发酵污水中的含N和S等有机物，主要包括NH3、H2S及甲烷等。污水中的有机氮经氨化作用分解生成氨，作为硝化和同化作用的底物，氨主要以NH4+-N的形式溶于水[12]，待NH4+-N饱和后便转化为NH3释放到大气中[13]，H2S产生于厌氧阶段-硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)还原高浓度硫酸根离子的过程[14]，因此对于污水中的污染物进行监测，可加深对于全过程除臭工艺的认识。
本研究以典型含N和含S污染物为主要探针，对多构筑物中的液相和气相污染物进行监测，以期评估全过程除臭工艺的效果。考察进水、粗格栅、曝气沉砂池和沉淀池污水中的[NH4+-N]和H2S的质量浓度，监测粗格栅、污泥储池、污泥脱水泵房及污泥堆场废气中的H2S、NH3等的质量浓度，研究模拟换气环境下工艺关键环节及厂界的H2S、NH3及臭气的浓度等，通过分析各关键工艺节点的气液两相中污染物的主成分及排放通量特征，识别关键污染风险点，并参照相关标准评估该工艺的应用效果，以期为开发污水处理厂的减污降碳除臭工艺提供参考。
1. 材料与方法
1.1 再生水厂全过程除臭工艺概况
北京市某再生水厂目前规模为2.0×104 m3·d−1，主工艺为A2/O，工艺流程如图1所示。再生水厂采用的是北京某环保科技有限公司的HBR(Hanmee Bio-Reactor)全过程除臭技术，该技术中微生物培养箱内置双层填料。1) 催化填料 (PELLET) ：火山灰、高岭土、褐铁矿石、石灰石等；2) 载体填料 (STONE) ：改性沸石、白斑石等。在好氧环境下，污水流经培养箱，催化填料可筛选代时短、高效降解NH3和H2S的微生物，多孔填料巨大的比表面积有利于微生物附着与增殖扩繁[15]。全过程除臭微生物培养箱直接安装于生化池内，开放式浸泡且无需额外曝气供氧，48 h后将含有除臭微生物的剩余活性污泥以5%~10%的比例回流进入预处理前段。该技术除臭的指标 (NH4+-N、NH3、H2S、臭气) 与阈值需满足北京市《大气污染物综合排放标准》 (DB11/501-2017) 和《城镇污水处理厂污染物排放标准》 (GB18918-2002) 。
1.2 工艺关键环节的气相-液相监测点布设
微生物除臭是一个部分臭气溶于水，即气相在液相中传质，而后被微生物除去的过程。此外，气相中的污染物又是来源于液相，在液相中浓度饱和后会逸散出。本研究将污水和气体污染物进行联合检测，每间隔2 h采集1次样品，连续采集12 h。具体监测点位、样品属性和指标如表1所示。
表 1 监测点位、监测样品、监测指标Table 1. Monitoring points, samples, indicators相属性 序号 监测点位 监测样品 监测污染物 备注 液相 1 提升泵房进水 废水 H2SNH4+-N 该点位位于工艺图上的① 粗格栅 污泥回流后，与污水充分混合后采样，该点位位于工艺图上的② 旋流沉砂池出水口 该点位位于工艺图上的③ 污泥沉淀池 污泥静置，取上清液，该点位位于工艺图上的④ 气相 2 粗格栅 废气 H2SNH3 回流污泥与污水充分混合后采样，需密封空间，按无组织采样 污泥储池 废气 密封后，按无组织采样 污泥泵房 废气 密封后，按无组织采样，车间内采样 污泥堆场 环境空气 提前清理场地，后按无组织采样 3 粗格栅 废气 H2S 模拟每小时6次换气，从构筑物中于日较大和较小水量时段采样 (无组织) NH3 臭气 4 厂界无组织废气 无组织废气 H2S 在单位周界采样 NH3 | Show Table
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1.3 臭气分析方法
采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮 (NH4+-N)质量浓度；硫化氢气体检测仪测定H2S质量浓度；NH3采用次氯酸-水杨酸分光光度计法[16]。
2. 结果与讨论
2.1 液相中NH4+-N和H2S的削减分析
含除臭微生物的污泥回流进预处理段，不仅可提高出水水质、降低剩余污泥产率，且可对污水中的H2S和NH4+-N等进行削减[17]。图2表明，初始污水中[NH4+-N]远高于H2S的质量浓度，分别为55 mg·L−1和6 mg·L−1，这说明污水厂进水中底物N的质量浓度高于S的质量浓度。
图 2 关键工艺节点气相中污染物质量浓度Figure 2. Mass concentration of pollutant in the key process node图2(a)表明，[NH4+-N]在进水处约为55 mg·L−1，而后流经粗格栅和旋流沉砂池，呈缓慢下降趋势。经过生化段处理后进入沉淀池，质量浓度骤然下降至5 mg·L−1，在这一阶段，[NH4+-N]得到了极大削减。这表明生化池中有利于NH4+-N去除的微生物丰度较高[18]，涉及的微生物可能为硝化菌及除臭填料箱中富集的除臭优势菌如芽孢杆菌、脱硫杆菌等。该过程为NH4+在脱氨基的作用下，转换成NH3的游离状态，NH3与碳水化合物结合，进而转化为醋酸形态及氨基酸化合物，在污泥螯合化下絮凝去除，同时电子水溶体可为微生物细胞增殖提供能量[19]。在此过程中，不排除活性污泥对NH4+-N的直接吸附。由于活性污泥主要是由真菌菌丝构成，而真菌的表面具电负性，故二者可产生一定的静电吸引作用。
图2(b)表明，H2S质量浓度在进水处约为6 mg·L−1，流经粗格栅后，H2S质量浓度大幅度削减至0.8 mg·m−3。这表明回流污泥中含有大量脱硫的微生物如硫杆菌[20]，与谢嘉倩等[21]的研究结果一致，H2S在具复合填料的生物滤柱中大量减少。微生物测序结果表明硫杆菌对H2S的降解起到了主导作用，H2S被氧化成硫酸。而后经曝气沉砂池至沉淀池，H2S质量浓度逐步缓慢削减至0.1 mg·L−1以下。在H2S的去除过程中，由于其表面不带电，故活性污泥对H2S的吸附效能弱。
对比图2(a)和2(b)，污水中的[NH4+-N]和H2S质量浓度在12 h内保持稳定。这说明培养箱中的微生物经过驯化挂膜后，微生物群落结构趋于稳定。YIN等[22]也同样证明了这一点。在微生物对底物的不断降解中，实现了产物组分的平衡和微生物群落结构的稳定，微生物之间通过协同、互营共生作用，形成了互补的生态位及顶级群落。此外，2种污染物在不同的工艺环节去除效果不同，这是由于构筑物内所富集的除臭优势菌群不同，侧面论证了微生物与外界环境有极大的响应关系。根据环境中检测到的污染物浓度可推知微生物的活跃程度，进而指导外界条件如曝气、回流等因素的调控。
2.2 气相中的H2S、NH3和臭气等浓度削减分析
1) 关键构筑物中大气污染物分析。由图3可见，粗格栅、污泥泵房、污泥储池和污泥堆场中的NH3质量浓度均较高，分别约为0.40、0.20、0.15和0.15 mg·m−3，高于H2S的质量浓度 (0.04、0.16、0.02和0.01 mg·m−3) ，与水中的[NH4+-N]和H2S质量浓度，即与前驱体含量趋势保持一致。这说明除臭微生物中脱氮类芽孢杆菌与脱硫杆菌的微生物降解作用相当[23]。
图 3 气相中的气体污染物质量浓度Figure 3. Mass concentration of gaseous pollutants in the gaseous phase图3 (a)和(b)表明，NH3质量浓度依次为：粗格栅>污泥储池>污泥泵房>污泥堆场；H2S质量浓度的顺序依次为：污泥储池>粗格栅>污泥泵房>污泥堆场，即粗格栅和污泥储池中的H2S及NH3质量浓度较高。其他学者也得到了相似结论。曹令通[24]发现厂区内易产生臭气的场所主要为粗细格栅、进水泵房、沉砂池及污泥深度脱水车间。这是由于污水进粗格栅是工艺的初始环节，即使污泥有一定回流，由于微生物降解有机物的动力学缓慢，生化反应需要一定时间，从而导致NH3在进水区质量浓度较高[25]；但经生物处理后，在生化池浓度大幅降低[26]。分析其原因，NH3进入微生物体内后，在氨加单氧酶( AMO) 的作用下被氧化生成羟胺，然后在羟胺氧化还原酶(HAO) 的作用下被氧化生成 NO2－，最后部分NO2－在NO2－氧化还原酶的作用下被氧化生成NO3－而溶解在水中，另一部分NO2－在厌氧反硝化细菌的作用下转化为气态氮化物N2和N2O[27]。图3(b)表明，污泥储池的H2S质量浓度较高，同时在检测中也发现污泥储池内上浮污泥有变黑发臭现象，这种情况系污泥堆积形成了大面积的厌氧环境，厌氧菌消化含S有机底物所致[28]。污泥泵房和污泥堆场的H2S及NH3质量浓度均较低，已达到北京市《大气污染物综合排放标准》中低于15 m排气筒的排放标准。
2) 重污染点位模拟排气后标准符合性分析。为考察污水厂经过全过程除臭后是否满足北京市的排放标准，本研究模拟和监测了排气后构筑物中污染物的含量。图4展示了粗格栅提升泵房集水井空间内模拟6次·h−1换气条件下废气的质量浓度。H2S、NH3和臭气质量浓度分别为 0.027~0.036 mg·m−3、0.023~0.031 mg·m−3和10~15，满足北京市《大气污染物综合排放标准》 (DB11/501-2017) 中15 m排气筒的排放标准H2S 0.5 mg·m−3，NH3 1.0 mg·m−3，和臭气浓度100的限值要求。
图 4 粗格栅提升泵房空间内模拟排气条件下各种气相污染物质量浓度Figure 4. Coarse grilles lift pump room space to simulate exhaust gas concentrations3) 厂界大气污染物标准符合性分析。污染物在气相中易扩散，故污水厂构筑物中的臭气如果削减不彻底很容易逸散到厂界。由于该厂周围有大量居民区，故厂界臭气的达标十分必要。图5(a)和5(b)展示了全过程除臭工艺后厂界的NH3和H2S质量浓度，二者在上风向的检测值均低于下风向，最高值为0.100和 0.007 mg·m−3，这也和液相中[NH4+-N]高于H2S质量浓度结果一致。此外，厂界臭气 (无量纲) 浓度均小于10，符合北京市《大气污染物综合排放标准》 (DB11/501-2017) ，厂界甲烷浓度为1.7×10−6，满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》 (GB18918-2002) 。
2.3 全过程除臭工艺的减污降碳协同增效分析
1) 关键构筑物中气液两相污染物削减分析。针对含N底物，经过微生物的作用，N在液相中以NH4+-N形式存在，而气相中是以NH3形式存在，二者的削减趋势保持一致。NH4+-N随水流经过粗格栅、旋流沉砂池和生化污泥池，其含量呈现削减的趋势；而NH3在粗格栅处浓度最高，随后在污泥储池、泵房和堆场等敏感点位亦呈现削减的趋势。对于含S底物来说，S 在气液两相中均以H2S形式存在。在液相中，污染物H2S的削减趋势与NH4+-N保持一致，即在粗格栅处浓度较高，在后面的敏感点处浓度进一步削减，同时气相中H2S质量浓度表现也与液相类似。总体而言，含S和含N污染物在气液两相中随着工艺环节的进行，污染物质量浓度都得到了相应削减，全过程除臭工艺达到了减污的效果。
2) 基于微生物机制的低碳除臭分析。微生物除臭过程是气体扩散和生化作用的综合反应。首先，气相中的水溶性物质NH3、H2S和挥发性脂肪酸( VFAs) 等溶于水中，脂溶性物质等因难溶于水而粘附在水体表面[29]；其次，细胞内外渗透压差驱动水溶性物质扩散到菌体细胞内；吸附在含有疏水层菌体表面的脂溶性物质被菌体细胞分泌的胞外酶降解，形成可溶性物质后，通过扩散作用进入菌体细胞内[30]；最后，进入菌体内的NH3被氧化生成 NO2－、NO3－、N2和N2O，H2S被自养型硫氧化细菌氧化生成SO42－[31]。在上述微生物除臭的过程中，无需外界能量参与，污水中的N、P、S等作为微生物增殖扩繁、降解底物的原动力。此外，液相中NH4+-N和H2S的削减有利于气相污染物的源头控制，而富集驯化后的菌群充斥在整个工艺系统中，又有利于气相污染物的削减。因此，全过程除臭是一项低碳高效的技术。
3. 结语
北京某再生水厂采用全过程除臭技术，针对选定关键工艺节点和厂界的气液两相污染物浓度进行监测及分析，解析污染物排放规律，分析潜在风险点，为再生水厂的运行提供技术支持，实现了水厂除臭过程中的减污降碳协同增效。全过程除臭的核心是微生物顶级功能群落的形成，恶臭气体成分的脱除是由多种微生物协同促进或共代谢实现。在后续的研究中，建议利用宏基因或代谢组学技术研究全过程除臭微生物菌群的时空演变规律及微生物代谢规律，关联水厂中气液两相污染物的质量浓度变化，分析恶臭物质的降解动力学及代谢过程，以揭示恶臭物质响应微生物群落及代谢过程变化规律，进一步优化全过程微生物除臭工艺和技术，为微生物除臭过程中的减污降碳技术提供理论基础。
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图 1 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻比生长速率的影响
Figure 1. Effects of CdSe (ZnS-CA QDs) on the specific growth rates of Chlorella vulgaris
图 2 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻细胞形态和数量的影响
Figure 2. Effects of CdSe (ZnS-CA QDs) on the morphology and quantity of Chlorella vulgaris
图 3 普通小球藻在不同暴露浓度下对CdSe(ZnS-CA QDs)的吸收/吸附量（以Cd含量计）
Figure 3. Amount of Cd associated with Chlorella vulgaris after exposure to different initial concentrations of CdSe (ZnS-CA QDs)
图 4 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻酯酶活性的影响
Figure 4. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on esterase activity of Chlorella vulgaris
图 5 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻细胞膜完整性的影响
Figure 5. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on cell membrane integrity of Chlorella vulgaris
图 6 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻线粒体膜电位的影响
Figure 6. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on mitochondrial membrane potential of Chlorella vulgaris
图 7 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻细胞内活性氧含量的影响
Figure 7. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on the content of reactive oxygen species in Chlorella vulgaris
图 8 CdSe(ZnS-CA QDs)对普通小球藻细胞光合作用的影响
Figure 8. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on Photosynthesis of Chlorella vulgaris
表 1 小球藻各生化指标的测定方法
Table 1. Methods for the determination of biochemical indices of Chlorella vulgaris
染色剂 Reagents 用量/µL Dosage 避光孵育时间/min Incubation time in the dack 对应荧光通道 Fluorescence filters FDA 25 8 FL1 PI 60 20 FL2 Rh123 26 30 FL1 H2DCFDA 100 60 FL1
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表 2 CdSe(ZnS-CA QDs)对小球藻生长的影响（暴露4 d）
Table 2. Effects of CdSe(ZnS-CA QDs) on growth of Chlorella vulgaris (Exposure to 4 d)
量子点初始浓度/(nmol·L−1)CdSe QDs dose 生长抑制率/%Growth inhibiting rate 0.2 10.2±2.7 1 61.5±10.1 5 73.3±6.2 10 74.8±27.6 20 82.9±10.1
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表 3 小球藻在不同CdSe(ZnS-CA QDs)初始暴露浓度下，对量子点的吸收/吸附率
Table 3. Absorption/adsorption rates of CdSe(ZnS-CA QDs) at different initial exposure concentrations
量子点初始浓度/(nmol·L−1)CdSe QDs dose 量子点吸收/吸附率/%Absorption/adsorption rates of CdSe QDs 0.17 d 1 d 2 d 4 d 0.2 58±5 33±5 30±5 28±3 1 78±2 52±7 48±6 48±9 5 No data 67±4 67±2 58±3 10 No data 79±8 75±2 73±1 20 No data 92±5 85±1 89±1
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