本研究所用煤炭样品采自山西省汾西县某选煤厂。对煤样进行研磨筛分，制备成粒度为0.075~0.150、0.280~0.400与0.500~1.000 mm的煤炭样品。其中0.075~0.150 mm粒度的煤炭样品中全硫、硫铁矿硫、硫酸盐硫含量分别为3.18%、2.45%、0.136%；0.280~0.400 mm和0.500~1.000 mm粒度的煤炭样品中全硫、硫铁矿硫、硫酸盐硫含量分别为2.96%、2.41%、0.121%和2.73%、2.17%、0.062%。

将15 mL氧化亚铁硫杆菌休止细胞液与135 mL的9K液体培养基置于一系列250 mL玻璃三角瓶中，于温度28 °C，转速180 r·min⁻¹的恒温振荡器中培养。待体系Fe²⁺完全氧化后将培养液抽滤，取15 mL滤液重新接种于135 mL的9K液体培养基中在前期相同条件下继续培养。该过程重复2次后将细菌培养液于4 ℃、12 000 r·min⁻¹的条件下离心15 min，弃去上清液，利用pH=2.50硫酸溶液悬浮离心管底部沉淀的菌体，硫酸与离心菌液的体积比设置1﹕30^[23]，制备出浓缩30倍的氧化亚铁硫杆菌休止细胞液。

分别将10 g粒度为0.075~0.150、0.280~0.400、0.500~1.000 mm的煤炭样品置于容积为250 mL的玻璃三角瓶中，加入148 mL去离子水、1 mL浓缩10倍的无铁改性型9K培养基 (培养基包含35 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、5.83 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.58 g·L⁻¹ K₂HPO₄、1.198 g·L⁻¹ KCl、0.168 g·L⁻¹ Ca(NO₃)₂) ，每12 h用3 mol·L⁻¹ H₂SO₄调节体系pH，72 h后各处理体系pH稳定至2.0后加入1 mL浓缩30倍的休止细胞液后，测定各体系初始pH、总Fe、Fe³⁺、Fe²⁺与SO₄^2-的浓度。然后，将三角瓶用消毒的八层纱布封口后放置于28 ℃，180 r·min⁻¹的恒温振荡器中开展煤炭生物浸出脱硫实验，每隔24 h测定体系pH，每72 h从各处理体系收集1 mL样品，通过0.22 μm硝酸纤维素膜过滤，用于测定总Fe、Fe³⁺、Fe²⁺与SO₄^2-的浓度。实验过程中各体系挥发的水分通过蒸馏水补充。每个处理初始设置6个重复，并于168 h、360 h各取3个重复混合均匀后，分析体系微生物产生胞外聚合物的化学组成。同时对体系生物浸出后的煤炭在XFD-12型浮选机中进行进一步的浮选脱硫研究。具体为将生物浸出完成时刻的体系溶液放入浮选槽中，加入30 μL煤油以及100 μL仲辛醇并加水至1 L刻度线，置于浮选机中，调节页轮转速至1 736 r·min⁻¹，浮选15 min，刮泡5 min。收集精煤与尾煤，并将煤样于50 ℃下烘干至恒重，测定精煤与尾煤的干重以及硫铁矿的含量。

根据Bhattacharyya与马蓉等^[26-27]描述的方法测量煤中硫铁矿含量。浸出脱硫与浮选脱硫的效率使用总脱硫率(式(1))、浸出脱硫率(式(2))、浮选降硫率(式(3))、精煤产率(式(4))4个指标进行评价。

式中：$ {R}_{\mathrm{z}} $代表总脱硫率，%；$ {R}_{\mathrm{j}\mathrm{c}} $代表浸出脱硫率，%；$ {R}_{\mathrm{f}\mathrm{x}} $代表浮选降硫率，%；$ {R}_{\mathrm{j}\mathrm{m}} $代表精煤产率，%；Sv为原煤的硫铁矿硫含量，%；Sc为浸出后煤炭的硫铁矿硫含量，%；Sj为浮选后精煤的硫铁矿硫含量，%；Nj为精煤干质量，g；Nc为尾煤干质量，g。溶液pH和氧化还原电位(ORP)采用pH-3C型测定(上海佑科)，测定精度分别为0.01与1。采用1,10-邻菲罗啉法测定溶液中总Fe和Fe²⁺浓度，总Fe浓度与Fe²⁺浓度差值即为Fe³⁺浓度^[23]。采用离子色谱 (IC6200，皖仪科技) 测定溶液中SO42-含量。采用EDTA法提取体系微生物分泌的胞外聚合物。具体为，将15 mL煤炭浸出脱硫体系混合溶液与等体积质量百分比为2%的EDTA·2Na溶液混合并反应3 h，随后于4 ℃、12 000 r·min⁻¹离心20 min后取上清液，即为粗提细胞胞外聚合物(EPS)溶液，EPS溶液装入截留分子质量为3 500 kD的透析袋后置于4 °C恒温蒸馏水中透析2 d去除溶液杂质，测定EPS溶液中的主要组分蛋白质与多糖含量。蛋白质与多糖含量分别采用考马斯亮蓝G-250法与蒽酮法测定^[28-29]。采用CuKαx射线源，利用热场发射扫描电镜(SEM,JSM-7001F，日本东京)与X射线衍射仪(XRD,MiniFlex II，日本东京)对煤的形貌和矿相进行分析。

煤炭生物浸出脱硫体系pH与氧化还原电位(ORP)可用来评价煤炭生物浸出脱硫的情况^[30-32]。由于氧化亚铁硫杆菌生物氧化煤系硫铁矿可产生H⁺、SO₄^2-和铁离子，因此，各粒度煤炭生物浸出脱硫体系pH随着反应时间的延长在48 h后呈现逐渐降低的趋势(图1)，而造成各处理体系在初始时pH在0~48 h内呈现小幅上升趋势的原因是体系Fe²⁺被氧化亚铁硫杆菌氧化至Fe³⁺是一个消耗H⁺的过程^[33]。随着氧化亚铁硫杆菌的加入体系内ORP值在24 h内显著增加，这一现象与叶俊培等^[34]的研究结果类似。然后体系内ORP值上升趋势放缓，煤炭生物浸出脱硫过程在360 h时，0.075~0.150 mm粒度的煤炭生物浸出脱硫体系pH值最低为1.82，ORP值最高为591 mV。可见煤炭粒度为0.075~0.150 mm的生物浸出脱硫体系反应更为快速。

煤系硫铁矿在O₂和氧化亚铁硫杆菌同时存在下发生生物氧化行为^[23]，化学反应方程如式(5)~(7)所示。这些反应反映了煤系硫铁矿生物氧化过程中固相FeS₂与液相中Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-之间的反应关系，可见液相Fe²⁺、Fe³⁺、SO₄^2-浓度可间接评价煤炭生物浸出脱硫效率。

1)各煤炭生物浸出脱硫处理体系Fe²⁺、Fe³⁺、总Fe浓度的变化。图2为各煤炭生物浸出脱硫体系反应至360 h时Fe²⁺、Fe³⁺和总Fe含量的变化情况。在尚未加入氧化亚铁硫杆菌的初始时刻，各体系含有一定量的Fe³⁺，其可能是由于前期用硫酸调节pH后，硫酸溶解煤中的含铁矿物(Fe₂O₃)导致溶出的Fe³⁺进入液相所致。与各处理液相Fe³⁺含量相比较，尽管在煤炭生物浸出脱硫过程中Fe²⁺浓度呈现小幅升高趋势(图2(a))，在浸出脱硫结束后各处理体系Fe²⁺含量仍低于40 mg·L⁻¹，各处理体系Fe²⁺对全Fe的占比相对较低。图2(b)~(c)分别为各煤炭浸出脱硫体系Fe³⁺含量与总Fe含量的变化，在0~48 h内体系的Fe³⁺与全Fe显著增加，后增长放缓。0.075~0.150 mm粒度的煤炭生物浸出脱硫体系中总Fe的溶出率显著高于其他两个体系，在生物浸出360 h时，该体系Fe³⁺浓度净增加值分别是0.500~1.000 mm和0.280~0.400 mm粒度煤炭浸出脱硫体系的3.52倍和1.28倍，全Fe浓度净增加值分别是0.500~1.000 mm与0.280~0.400 mm煤炭浸出脱硫体系的3.18倍与1.36倍。

2)煤炭生物浸出脱硫过程中SO₄^2-含量变化。煤炭生物浸出脱硫使得煤系硫铁矿中硫以SO₄^2-的形式进入液相。图3为各煤炭生物脱硫体系SO42-浓度的变化情况。各体系初始时刻有一定量的硫酸根，这是由于前期调节pH使得体系引入SO₄^2-所致。各处理体系在整个生物浸出脱硫期间，SO₄^2-浓度呈上升趋势。煤炭研磨越充分，粒度越小，体系硫铁矿单体解离度越高，致使硫铁矿与氧化亚铁硫杆菌接触更充分进而加速了其生物氧化进程^[35]。如图3，在生物浸出至360 h时，0.075~0.150 mm粒度组成的煤炭浸出脱硫体系SO₄^2-浓度净增加值最高为1 665.04 mg·L⁻¹，分别为粒度0.500~1.000 mm与0.280~0.400 mm的煤炭生物浸出脱硫体系SO₄^2-浓度净增加值的2.27倍与1.30倍。而总铁浓度由式(5)~(7)可知其总铁的浓度变化与硫酸根的浓度变换应呈正比关系，因此呈现相似的变化趋势(图3(c))，即随粒度的减小其总铁的净溶出量也随之升高。此外，在部分反应时刻(240 h)煤炭生物浸出脱硫体系中的SO₄^2-浓度呈现小幅下降趋势，这可能是由于液相中的SO₄^2-与煤炭中的钙结合生成硫酸钙吸附于煤炭颗粒表面或进入煤炭孔道所致。

3)煤炭生物浸出脱硫体系EPS含量的变化。图4为不同粒度煤炭生物浸出脱硫体系微生物分泌EPS中蛋白质和多糖浓度的变化。由图4(a)可以得出，当各煤炭浸出体系反应至168 h，随着煤炭粒度变大，生物浸出体系EPS中蛋白质含量逐渐降低。当煤炭生物浸出脱硫体系反应至360 h，除粒度为0.500~1.000 mm的煤炭生物浸出脱硫体系外，其余2个处理体系在360 h时的多糖含量均高于168 h。粒度为0.500~1.000 mm的煤炭生物浸出脱硫体系多糖质量浓度由168 h 的14.68 mg·L⁻¹降至360 h的10.22 mg·L⁻¹，而0.280~0.400 mm与 0.075~0.150mm粒度的煤炭生物浸出脱硫体系分泌的多糖质量浓度分别由168 h的0.76 mg·L⁻¹和46.84 mg·L⁻¹上升至360 h的15.35 mg·L⁻¹和57.24 mg·L⁻¹。煤炭生物浸出过程中，微生物吸附于煤系硫铁矿表面，其通过分泌EPS会降低含硫煤炭的接触角，进而降低含硫煤炭的可浮性。事实上，笔者在开展后续相关研究中发现，粒度为0.075~0.150 mm的原始煤炭接触角为111.4°，生物浸出至360 h时，煤炭接触角降至60.2°。

4)生物浸出脱硫时间对浮选脱硫的影响。由图2(c)与图3可以得知随着生物浸出时间的推移煤系硫铁矿以硫酸根与铁离子的形式进入液相，因而煤中的硫铁矿含量逐渐降低，各处理体系浸出脱硫率随浸出时间的增长而提高。由于粒度越小的煤炭其铁离子与硫酸根离子的溶出量越高，因而粒度为0.075~0.150 mm的煤炭浸出脱硫率相对最高，在第168 h与360 h分别达到34.3%与44.8%，而该体系微生物分泌蛋白质和多糖的含量也相对最高(图4)。这可能是由于煤炭粒度较小，促进了硫铁矿与氧化亚铁硫杆菌的接触，使得菌生长更加旺盛从而促进了EPS的分泌^[36]。由图5(b)可以得出，粒度为0.500~1.000 mm的煤炭生物浸出后的浮选降硫率随生物浸出反应时间的增长而增加，而粒度为0.280~0.400 mm与0.075~0.150 mm的煤炭生物浸出后的浮选降硫率随着生物浸出反应时间的增长而有所降低，换言之，在粒度为0.075~1.000 mm时，生物浸出后煤炭的浮选降硫率并没有随着体系微生物分泌蛋白质或多糖含量的增加而有所升高。TANG 等研究证实煤系硫铁矿含量与生物浮选降硫效率呈正相关^[19]，本研究中粒度为0.280~0.400 mm和0.075~0.150 mm的煤炭生物浸出脱硫效率相对较高，残留在煤炭中的硫铁矿相对较少，可能是导致其后续浮选降硫率较低的原因之一。由图5(c)可知，各粒度煤炭在168 h的精煤产率均高于同粒度360 h的精煤产率。可见，煤炭粒度较小，浮选精煤产率较高，生物浸出时间较短时(168 h)的煤炭浮选精煤产率高于较长(360 h)时间的浮选精煤产率。笔者认为，随着反应时间的延长，煤炭的接触角逐渐降低，致使煤炭上浮进入精煤的含量下降，进而降低了浮选精煤的产率。由图5d可以得出，煤炭生物浸出耦合浮选工艺总脱硫率随着时间的延长逐渐上升，其中粒度为0.075~0.150 mm煤炭的总脱硫率最高，从168 h的43.2%提高至360 h的54.0%。

5)生物浸出脱硫煤矿相分析。图6为粒度为“0.075~0.150 mm”煤炭样品生物浸出前后的XRD表征图。在原煤与生物浸出脱硫煤中均有高岭石[Al₂Si₂O₅(OH)₄]、石英(SiO₂)、方解石(CaCO₃)，在生物浸出第168 h与第360 h的煤炭样品中有CaSO₄·2H₂O产生，这可能证明图3中液相硫酸根浓度降低的原因。LIU等^[23]研究发现，高硫煤炭生物浸出脱硫27 d后，煤炭表面有次生铁矿物黄铁矾生成。本研究中相关体系未观察到次生铁矿物黄铁矾的生成，这可能是由于煤炭生物浸出时间相对较短且培养基供给相对较少所导致。

对0.075~0.150 mm粒度的原始煤炭与生物浸出脱硫后的煤炭进行形貌分析，在浸出脱硫体系观测到CaSO₄·2H₂O矿物的存在(图7(b)~(c))，CaSO₄·2H₂O的杆状形貌与前人研究结果一致^[37-38]。可见，煤炭生物浸出脱硫至168 h与360 h，生物脱硫煤炭表面确实均有CaSO₄·2H₂O的分布(图7(b)~(c))。在本研究中，粒度为0.075~0.150 mm的煤炭生物氧化进程最快。这一过程势必会促使煤炭中铁离子与硫酸根离子等更容易从固相中溶解进入液相，进而促进CaSO₄·2H₂O的生成。综上所述，高硫煤在生物浸出过程中硫酸根的变化至少呈现2个阶段：一个阶段是通过微生物生物氧化煤系硫铁矿促进SO₄²⁻从固相向液相释放的过程；另一个阶段则是随着体系的酸化，释放进入液相的SO₄²⁻与煤炭中钙结合生成CaSO₄·2H₂O吸附在煤炭颗粒表面或孔道中。换言之，煤炭生物浸出脱硫体系在某一时刻液相中SO₄²⁻变化规律应该是上述2个过程共同作用后的结果，当然这取决于煤炭中硫铁矿、碳酸钙等物质的含量。

1)煤炭粒度对其生物浸出与浮选耦合脱硫具有一定影响。煤炭生物浸出脱硫效率随煤炭粒度的减小而提高，煤炭生物浸出脱硫体系中有CaSO₄·2H₂O矿物产生。

2)利用氧化亚铁硫杆菌对粒度组成为0.075~0.150 mm的煤炭进行168~360 h的生物浸出脱硫时，煤炭脱硫率为34.3%~44.8%，耦合后续浮选工艺，煤炭总脱硫率可提高至43.2%~54.0%。相关参数可为改进煤炭生物脱硫工艺提供一定数据参考。